本发明专利技术涉及一种编码缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶的DNA序列，所述的DNA序列包括：a、SEQIDNO.10所述的核苷酸序列，或b、与a所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明专利技术还提供该核苷酸序列的重组表达载体和基因工程化的宿主细胞及其用途。本发明专利技术优点在于：通过对缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶基因的分子克隆和功能鉴定，证明了该基因编码的是Δ-6脂肪酸延长酶；为提高油料作物合成长链多不饱和脂肪酸的能力提供了理论基础，理论上可以将本发明专利技术的基因转入油料作物中，能够有效地延长γ-亚麻酸等花生四烯酸合成必需的前体物质，使这些油料作物具有合成长链多不饱和脂肪酸的能力，以提高其品质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA序列，具体地说，是一种编码缺刻缘绿藻Δ -6脂肪酸延长酶的DNA序列及其应用。
技术介绍
ArA (花生四烯酸，arachidonic acid，20 4n_6)是人类营养的一种必需脂肪酸，与二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA，22 6n_3)等一样都是人脑膜磷脂的主要成分，同时还有其它许多生理学及药理学活性。例如，它在细胞内发挥第二信使作用，参与造血免疫调节，引起血管舒张，参与肝、胆等器官多种功能的调节，是内循环系统和中枢神经系统中起重要作用的前列腺素和白介三烯的前体。ArA还是成熟母乳的一种重要成分，它对产后婴儿的视力和智力发育都是必需的。因此，FA0/WH0 (1994)推荐在婴儿奶粉中添加 ArA0目前ArA的商业来源主要是海洋鱼油和动物脏器，但两者含量都很低，分别只占干重的0. 2%和0. 5%，而真菌发酵生产ArA存在生产成本高、发酵周期长等缺点。微藻能够利用简单的无机盐为营养，吸收并转化光能，固定CO2，在细胞内合成并积累大量ArA。缺刻缘、缘佩Myrmecia incisa)是一种单细胞绿藻，属于绿藻门、jTrebouxiophyceae纲，细胞常聚集在一起形成类似非定形群体的细胞团。缺刻缘绿藻能够大量合成并积累ArA，尤其是在氮饥饿条件下，ArA含量可以达到藻体干重的7%甚至21%，而且95%以上的ArA是以三酰甘油(triacylglyceroLTAG)的形式贮存在细胞中，它们占脂肪酸总量的60%。这种藻不仅是目前已知藻类中ArA含量最高的物种，与其它含有多不饱和脂肪酸(PUFA)如DHA、EPA的藻类相比，缺刻缘绿藻的PUFA含量也是最高的。因此缺刻缘绿藻极有希望成为利用大型光生物反应器以工业化规模生产ArA的潜在物种。微藻中存在两条合成ArA的途径，即ω 6途径中的“ Δ 6途径”和“ Δ 8途径”。PUFA 的从头合成是从C18:ln-9开始，八12去饱和酶作用生成(18:2"9’12。在经典的“Δ6途径” 途径中，α8:2Δ9’12去饱和为α8:3Δ6’9’12，再延长为020:3"8'11'14和去饱和生成020:4"5'8'11'14 (ArA)0而在可替代的“ Δ8途径”途径中，α8:2Δ9’12延长为C20 2Δ11’14，再在去饱和酶作用下先后生成ε20:3Δ8’"’14和ArA。每条途径中延长酶和去饱和酶基因都是合成中的关键酶。 在氮饥饿限制下，ArA的合成和大量累积与这些基因的活性调节和功能有着必然的联系。中国专利文献CN1017M637A公开了一种球等鞭金藻Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用，该专利技术涉及一种从产DHA的球等鞭金藻中分离的编码Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用。中国专利文献CN1625597A公开了一种新的延长酶基因及多不饱和脂肪酸的制备方法，该专利技术涉及一种具有一序列的延长酶基因，或其同系物、衍生物或类似物，还涉及多不饱和脂肪酸的制备方法。但是关于编码缺刻缘绿藻△-6脂肪酸延长酶的DNA序列及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种编码缺刻缘绿藻△ -6脂肪酸延长酶的DNA序列。本专利技术的再一的目的是，提供一种重组表达载体。本专利技术的另一的目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。本专利技术的第四个目的是，提供以上所述DNA序列、重组表达载体和基因工程化的宿主细胞的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种编码缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶的DNA序列，所述的DNA序列包括a、SEQID NO. 10所述的核苷酸序列，或b、与a所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是一种重组表达载体，所述的载体是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。所述的载体是pYES2载体。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种基因工程化的宿主细胞， 所述的宿主细胞选自于下列一种宿主细胞a、用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；b、用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。所述的宿主细胞是酵母细胞。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是所述的DNA序列、所述的重组表达载体或所述的宿主细胞在生产多不饱和脂肪酸中的应用。本专利技术优点在于1、本专利技术通过对缺刻缘绿藻Δ-6脂肪酸延长酶基因的分子克隆和功能鉴定，证明了该基因编码的是Δ-6脂肪酸延长酶；2、本专利技术为提高油料作物合成长链多不饱和脂肪酸的能力提供了理论基础，理论上可以将本专利技术的基因转入油料作物中，能够有效地延长￥-亚麻酸((18:3"6’9’12， y-linolenic acid, GLA)等花生四烯酸合成必需的前体物质，使这些油料作物具有合成长链多不饱和脂肪酸的能力，以提高其品质。附图说明附图1是5 ‘-和3 ‘-末端RACE扩增的电泳图谱。M: DL 2000分子量标准； 5'-末端产物长度为913 bp ;3'-末端产物长度为634 bp。附图2是基因DNA全长结构示意图。附图3是GC-MS检测酵母的脂肪酸组成。A 没有添加底物的；B 添加GLA (C18:3A6,9,12) ;C 添加SDA (C18:4A6,9,12,15) ；& :野生型对照组；b 转空载体对照组；C 含有MiFAE的转基因酵母Y-MiFAE。箭头指示的是添加外源的脂肪酸底物，粗箭头指示其产物。附图4是附图3中两个产物的质谱鉴定。1和2分别表示两个产物DGLA和ETA的质谱鉴定。 具体实施例方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。 实施例1、材料1)缺刻缘绿藻incisa Reisigl H4301)来自 CAUP (Culture collection of algae of Charles University of Prague)。在温度为 25°C、光照强度为 115 μ mol photons m_2 s—1、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为BG-Il。2)pYES2载体和酵母 INVScl 菌株(His\LeiT Jrp-及 togf 缺陷型)购自 hvitrogen 公司。酵母在YPD培养基(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖培养基)，于30°C下以220 rpm转速振荡培养。2、方法1)取100 mg新鲜的藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。2 ) CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取基因组DNA和TRIzo 1法抽提总 RNA，-20°C保存备用。3)根据cDNA文库中筛选得到的延长酶基因的表达序列标签(EST)设计引物 5R417 (5' -RACE) CTTCCGAGTGTTCCCTCTTGCTTCTGTG (SEQ ID NO. 1)3R18 (3' -RACE) AACCCTCACTCAGTTCCAGATGTTCCAG (SEQ ID NO. 2) 利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)方法扩增 5'-端和 3'-端片段。首先按照说明书操作步骤合成5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种编码缺刻缘绿藻Δ－６脂肪酸延长酶的ＤＮＡ序列，其特征在于，所述的ＤＮＡ序列包括：ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０所述的核苷酸序列，或ｂ、与ａ所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，于水燕，刘士成，李慧，吴洪，
申请(专利权)人：上海海洋大学，新奥科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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