一种抗氧化多肽及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗氧化多肽及其制备方法，该方法以鲨鱼皮胶原蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性抗氧化多肽，其分子量在902Da，其氨基酸全序列为：Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。本发明专利技术消除了天然抗氧化剂所具有的缺陷并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了，属于生物

技术介绍
生物分子的氧化是一个自由基介导的过程，它会对食品和生物系统造成许多不利的影响。在好氧器官内，与动脉硬化、癌症等多中疾病相关的游离自由基会不可避免地随着氧代谢的过程而产生。在食品中，食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、TBHQ等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α -生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。现有的研究发现，很多不同来源的水解蛋白都具有一定的抗氧化能力，如酪蛋白、 大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等的水解物都具有一定的抗氧化性。虽然多肽发挥抗氧化活性的机理还不是特别清楚，但是有报道称某些芳香族氨基酸和组氨酸起到了重要作用。国内外的研究发现，胶原蛋白来源的肽比其它蛋白源肽具有更高效率的抗氧化性。而鱼皮中胶原蛋白占总蛋白质的80%以上，从获得胶原蛋白的效率来看，鱼皮是获得胶原蛋白的重要来源。明胶中富含疏水性氨基酸以及其它与脂类具有较高亲和性并且可以形成稳定乳化体系的氨基酸，故被认为是制备抗氧化多肽的良好原料。因此，如何从明胶中获得具有特定氨基酸序列的高效抗氧化多肽就成为迫切的研究方向。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了，使抗氧化活性得以高效地实现。本专利技术的一种抗氧化多肽，氨基酸序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ar g_Gly。本专利技术还提供了一种抗氧化多肽的制备方法，以鲨鱼皮为原料提取胶原蛋白，然后采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为 PH为3. 0、温度50°C、酶解时间为5h、酶-底物配比为3000U/g ；所述酶为酸性蛋白酶。所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C_25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和 RP-HPLC反相高效液相色谱。所述分离纯化的具体步骤为3(1)酶解产物首先利用分子量截留范围为SOOODa和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于SOOODa的组分、分子量介于3500Da和SOOODa的组分、分子量小于3500Da的组分；(2)收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-S^hadex C_25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱， 流速为0. 5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；(3) 收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0. 5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性； (4)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，反相HPLC的分离以含0. 1% (体积)三氟乙酸的浓度梯度为5% 40%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100 μ L，流速为lmL/min，检测波长为215nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的三个组分；(5)利用RP-HPLC反相高效液相色谱对三个组分进行鉴定，以含IOmM乙酸铵的浓度梯度为5% 27. 5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20 μ L，流速为lml/min，检测波长为215nm，三个组分均分别分离得到单一的峰，即得到三个纯的活性组分；利用蛋白质固相序列分析仪鉴定三个肽的氨基酸序列，得到本专利技术的抗氧化多肽的氨基酸序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。为了实现上述方案，本专利技术采取的具体步骤如下 (1)胶原蛋白的提取本专利技术所采用的鲨鱼皮为市售。鲨鱼皮经水洗3次以除杂，然后捣碎(长度<lcm)，再用0. Imol/L的NaOH溶液(料液比w/v=l :6)在4°C下浸泡Mh。水洗至中性后浙干水分，再加入0. 03w%的HCl溶液(料液比w/v =1:6)，在4°〇下浸泡41!后再水洗至中性。最后，加入蒸馏水(料液比w/v =1:6), 60°C水浴6h，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到胶原蛋白。(2)胶原蛋白的酶解酶购自福州福大百特生物试剂公司(中国·福州)。采用酸性蛋白酶酶解鲨鱼皮胶原蛋白，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件取pH为 3.0、温度501、酶解时间为5h、酶与底物比为(3000U/g)，用2M HCl调节pH稳定，水解5h 后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。(3)酶解产物的分离、纯化将得到的酶解产物利用分子量截留范围为SOOODa和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于SOOODa的组分、分子量介于3500Da和SOOODa的组分、分子量小于3500Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过SP-S印hadex C_25阳离子交换色谱(长20cm，直径1. 6cm)进行分离，以含 0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为 0. 5ml/min ；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50 (长100cm，直径2. 6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0. 5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，反相HPLC的分离以含0. 1%三氟乙酸(体积)的浓度梯度为5% 40%的乙腈溶液进行梯度洗脱， 所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100 μ L，流速为lml/min,检测波长为215nm,收集得到抗氧化活性最高的三个组分。(4)抗氧化多肽的鉴定利用RP-HPLC反相高效液相色谱对三个组分进行鉴定，以含IOmM乙酸铵的浓度梯度为 5% 27. 5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20 μ L，流速为lml/min，检测波长为215nm，三个组分均分别分离得到单一的峰，说明得到三个纯的活性组分，进一步鉴定肽的氨基酸序列。(5)抗氧化活性的测试利用DPPH( 1，l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种抗氧化多肽，其特征在于：所述抗氧化多肽的氨基酸序列为Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪少芸，江勇，林月萍，王军，祝贝贝，赵立娜，赵珺，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：35