一种高效的双子叶百草枯表达载体制造技术

本发明专利技术提供了一种高效的双子叶百草枯表达载体，该表达载体包含一个表达盒和virG序列，表达盒依次包括双LB、Mar、35s、PQR5、Tocs、P-Bch、PQR5、Tnos、Nos、RB。该双子叶表达载体能够提高PQR5基因在双子植物中的表达量，获得具有高百草枯抗性的双子叶转基因植物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因植物
，具体而言，本专利技术涉及一种高效的双子叶百草枯载体。
技术介绍
转基因技术是现代生物技术的核心，利用转基因技术生产优质、多抗、高效、多产的作物新品种，是缓解资源束缚、保护环境安全以及拓展农业功能的重要途径。发展和完善现有转基因技术具有重要的实际应用价值。在实际基因转化操作过程中，只有小部分的植物细胞能够吸收外源DNA并整合到植物基因组上，仍有大部分植物细胞处于未转化状态， 为了从数目庞大的植物细胞中筛选得到外源DNA整合的植物细胞，需要筛选标记基因的辅助。现在常用的筛选标记基因主要有抗生素类和除草剂两类。抗生素抗性基因因具有高转化效率和方便筛选等优点而成为最常用的筛选标记。 但是人们担心抗生素抗性基因会转移到微生物中，使病原菌带有抗生素抗性从而导致临床上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的价格昂贵，作为筛选标记成本高。因此，抗生素抗性基因作为筛选标记多用于科学研究过程中。除草剂抗性基因是近几年来发展起来的一种新型的筛选标记与抗生素抗性基因相比，除草剂抗性基因具有价格低的优点，也不会产生临床抗生素失效等担忧，同时除草剂抗性基因不仅是筛选标记基因还是一种目的基因，能使转基因作物具有良好的除草剂抗性性状。现在主要使用的除草剂抗性基因有草甘膦抗性基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦价格相对较高使得草丁膦抗性基因作为筛选标记基因主要用于实验室研究。草甘膦抗性基因是应用比较多的一种筛选标记基因。虽然除草剂抗性基因是产业化转基因筛选的优良选择标记基因，但是其尚未得到大规模的应用。这主要由除草剂抗性基因单一造成的，目前大多数的除草剂抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基础上修饰得到的，新型的除草剂抗性基因的研究一直没有显著进展。研发一种新型的除草剂抗性基因是一项工作量巨大而且具有很大不确定性的工作。百草枯(paraquat，1，1_二甲基_4，4’-联吡啶，分子量257. 2)是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、 林带等作物的杂草，在农业种植中的广泛应用已近50年，应用在世界范围内超过100个国家，受到广泛接受与欢迎。百草枯是非选择性除草剂，植物对其吸收非常迅速，即使喷药后短期内降雨也不影响药效的发挥。百草枯具有接受广泛、广谱性、药效明显、价格低等优点， 将是一种优良的植物转基因筛选剂，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以来没有突破性的进展，使得百草枯作为筛选剂也仅仅停留在实验预想阶段。本专利技术人通过漫长而艰苦的筛选实验，终于筛选得到了一个百草枯抗性基因，并此基础上专利技术了一种高效的双子叶百草枯载体，利用该表达载体，不仅可以获得高抗百草枯的转基因植物，还能减少对抗生素的使用，提高转基因植物的安全性，具有很大的实际应用价值和市场推广前景。。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高效的双子叶百草枯表达载体，该表达载体包含一个表达盒和 virG 序列，表达盒依次包括双 LB、Mar,35s, PQR5、Toes、P-Bch, PQR5、Tnos、Nos, RB。该双子叶表达载体能够提高PQR5基因在双子植物中的表达量，获得具有高百草枯抗性的双子叶转基因植物。“表达载体”是生物学领域的常用术语，是指含有一个或多个启动子顺序，能有效地促使插入的目的基因进行转录，进而翻译出该插入基因编码的蛋白产物的载体。本领域常用的表达载体以抗生素为筛选标记基因(比如PCAMBIA1300的筛选标记基因为HPT，产生潮霉素抗性；PCAMBIA2300的筛选标记基因为NPTII，产生卡那霉素抗性。)，本文所用的表达载体pCAMKT1300是将pCAMBIA1300的HPT基因置换成pqrK2基因，使其筛选剂由潮霉素变成百草枯。显然，本领域的技术人员可以轻易将常用的表达载体如PCAMBIA系列载体、 PBI系列载体、Pbin系列载体、Gateway载体系列的抗生素以及其他的筛选标记基因置换成 pqrK2使其具有百草枯抗性，这些修改也纳入本专利技术范围内。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本专利技术范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。另外，本专利技术引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本专利技术，它们的全文内容均纳入本专利技术进行参考，就好像它们的全文已经在本专利技术说明书中重复叙述过一样。附图说明图1为H(T6载体示意图谱。 具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。具体步骤可参见《Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David W. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例1 :H(T6表达载体的构建根据SEQ ID NO :1命名为MAR基因序列，设计引物时引入合适的酶切位点，设计引物 1:5，-TCGATTAAAAATCCCAATTATATT-3，，和引物 2: 5，-ACTATTTTCAGAAGAAGTTCCCA-3，，用引物1和引物2进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取pCAMBIA1303 (购自Cambia公司)用同样的酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到引入mar序列的H(T17的前体PPKT17。 根据SEQ ID NO :2命名为双LB序列，设计引物时引入合适的酶切位点，设计引物43:5，-TGGCAGGATATATTGTGGTGTA-3，，和引物 4 5，-TGTTTACACCACAATATATCCTGC-3，，用引物 3和引物4进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取上述H(T17的前体PPKT17用同样的酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2XYT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到引入 mar序列和双LB序列的PKT17的前体PPPKT17。根据SEQ ID NO :3命名为virG序列，设计引物时引入合适的酶切位点，设计引物 5:5，-TTATCAGGCTGCCATCGTC-3，和引物 6 5，-ATGAAACACGTTCTTCTTGTCG-3，，用引物 5 和引物6进行PCR扩增，然后酶切，得到插入片段；取用同样的限制性内切酶酶切PPH(T17，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的 2XYT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得到H(T17。设计带酶切位点的引物7: 5，-ATGGCAATGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高效的双子叶百草枯表达载体，该表达载体包含一个表达盒和ｖｉｒＧ序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：夏勉，刘军华，张斌，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11