适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶及其制备方法。所述胶原基冷冻凝胶是由从健康家畜动物皮或腱采取酶法提取得到的分子量为２８０～３２０ｋＤａ、三股螺旋结构保持完好的胶原蛋白质，经与醛化多糖交联改性反应，在模具中于０～－５０℃的低温条件下反应１～７天，出模缓慢解冻制得。本发明专利技术的胶原基冷冻凝胶制备，具体涉及胶原的提取、醛化多糖的制备、及醛化多糖－胶原基冷冻凝胶的合成。采用本发明专利技术制备的醛化多糖－胶原蛋白基冷冻凝胶，改善了单纯胶原蛋白凝胶的力学性能、热稳定性和抗酶降解性等，且冷冻凝胶具有多孔性、可塑性、亲水性、无毒性等优点，可作为生物支架、细胞培养、药物控释、生物敷料等生物医用材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及胶原冷冻凝胶(cryogel)
，更具体地说，是涉及适用于 生物医用材料的用从家畜动物皮或腱提取的胶原制取冷冻凝胶的

技术介绍
水凝胶广泛应用于生物支架、细胞培养、药物控释、生物敷料等生物医用领 域，其中应用于组织工程的水凝胶主要分为两大类合成高分子水凝胶和天然高 分子水凝胶。胶原作为一种重要的天然高分子凝胶原料，既可直接形成凝胶又可 以作为复合凝胶的基质，己经在生物医用材料领域得到广泛应用，如使用胶原基 凝胶作为生物支架来培养纤维原细胞、上皮细胞等，或作为创伤敷料等。己经知道，胶原是哺乳动物体中组成腱、软骨、皮肤和血管等细胞外基质的 主要蛋白质成分。天然胶原在分子水平上是一类具有Gly-X-y (X、 Y通常为Pro 或Hyp)三肽周期和独特的三股螺旋结构的纤维状蛋白质。从哺乳动物中提取得 到的、尤其是分子结构保持良好的胶原，区别于明胶，具有良好的生物相容性、 低免疫原性和生物可降解性。但是，单纯的胶原在使用时，如胶原凝胶，其力学 性能、热稳定性、抗酶降解性等方面还常常不能满足生物医用领域应用的要求。 因此，通常使用的胶原基生物材料都要经过物理或化学方法交联改性，以改善胶 原的物化和生物学方面的性能。至今被广泛采用的胶原改性方法主要有紫外线或 Y射线辐射交联(CN1944495A),或是以醛和金属离子等各种化学试剂交联。 虽然使用甲醛(CN1071587A)、戊二醛(CN1387923A)改性的胶原不会改变胶 原的基本构象及基本生物学功能,但有研究认为，由于醛与胶原的反应过程可逆， 生成schiff碱的结构不稳定，改性后的胶原在体内很容易水解产生具有代谢毒性 的游离小分子醛。因此通过甲醛和戊二醛改性后的胶原组织工程支架在体内会出 现抑制细胞生长、产生炎症反应甚至发生钙化的现象。虽然使用紫外线或Y射线 辐照交联胶原不会产生任何毒性成分，但是紫外辐照只能使胶原材料表面交联， 而且过量或长时间的紫外线或Y射线辐照会导致胶原构象改变甚至使胶原降解，因此照射时间和交联程度很难控制。此外，常被采用的改性方法还有以胶原与其 它天然高分子材料共混进行改性，如胶原一壳聚糖共混(CN1584150A),胶原 一透明质酸共混等。虽然共混改性能够借助氢键等次价键改善胶原的强度，并增 添了许多胶原不具有的优良性质，但是该方法改性的胶原在力学性能、热稳定性、 抗酶降解性等方面仍然不能满足组织工程支架的要求。考虑到上述原因，改性胶 原基凝胶时，必须考虑到交联剂的毒性、改性方法的易控制性及改性效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶及其制备 方法，以解决现有技术的胶原凝胶制备所存在的，改性操作方法不易控制性，制 备的胶原凝胶在体内容易水解产生具有代谢毒性的游离小分子醛，致使体内出现 抑制细胞生长、产生炎症反应甚至发生钙化，或胶原凝胶的力学性能、热稳定性、 抗酶降解性等方面不能满足材料性能要求的问题。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案-适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，是由从健康家畜动物皮或腱采取酶 法提取得到的分子量为280 320kDa、三股螺旋结构保持完好的胶原蛋白质，经 与醛化多糖交联改性反应，在模具中于0 一50'C的低温条件下反应1 7天， 出模缓慢解冻制得。在上述技术案中，醛化多糖与胶原的用量比例，按干重计为1 : 1 500，优 选范围为1 :5 100。在上述技术案中，所述醛化多糖是以淀粉、透明质酸、硫酸软骨素等多糖及 其衍生物为原料，采用高碘酸钠氧化制备的，醛基重量含量在30% 95%范围的 醛化多糖。在上述技术案中，所述胶原是以清洁新鲜的健康家畜动物皮或腱为原料，，经 丙酮脱脂、干燥、粉碎加工成料屑，以10重量份的料屑溶解在600 800重量份 的0.5mol/L醋酸溶液中，加入0.01 0.02重量份的胃蛋白酶，在5 25'C下酶解 48 72h后离心取上清液，于4 6'C下经NaCl或(NH4)2S04盐析，再经透析、 冻干处理制备得到的胶原干品。在上述技术案中，所述醛化多糖是以10重量份的多糖加入到多糖15~25倍重量份的蒸馏水中在25 45'C下溶解，再加入5 25重量份的高碘酸钠，在 pH1.5 4.0下反应2.5 10h，然后加入反应液2—7倍体积的丙酮沉淀，再经过 滤、洗涤、干燥、粉碎处理制备得到的醛化多糖。以上所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其制备方法包括以下三 个操作步骤-(1 )称取1 50重量份胶原干品，加入蒸馏水在4 6'C下不断搅拌6 12h, 得到浓度为0.1 5重量％的胶原溶液；(2) 称取0.1 10重量份的醛化多糖，加入蒸馏水在70 8(TC加热并不断 搅拌0.5 lh,室温冷却后得到0.01 1重量％的醛化多糖溶液；(3) 室温条件下，将浓度为0.01 1重量％醛化多糖溶液和浓度为0.1 5 重量％胶原溶液按干重计以1 : 1 500的重量比例混合，并将以胶原干品重尊计 的共混液浓度控制在0.01 5%, pH范围在4 9,在室温下搅拌2 6h后，将混 合均匀的醛化多糖一胶原蛋白溶液注入模具，在0 一50'C的低温反应器中贮藏 反应1 7天，最后取出模具缓慢解冻，即制备得到醛化多糖—胶原基冷冻凝胶。本专利技术利用醛化多糖与胶原上的氨基(主要是赖氨酸上的s—氨基)生成 schiff碱的反应，是以胶原为基质，在低温条件下使其与醛化多糖交联反应一定 时间，再经解冻制得醛化多糖一胶原基多孔异相冷冻凝胶(Cryogel)。本专利技术采 用低温反应条件，避免了其它改性方法中易产生的胶原热变性现象，有利于保持 胶原的天然三股螺旋结构和优良的生物学特性。特别是通过冷冻一解冻法制备醛 化多糖一胶原基冷冻凝胶，克服了单纯胶原力学性能差、热稳定性低、抗酶降解 能力弱等问题，并且交联后的凝胶内部具有多孔三维网络结构，更利于成型。此 外，大分子的醛化多糖也具有优良的生物学性质，如无毒性、生物可降解性和组 织相容性等，因此所制备的醛化多糖一胶原基冷冻凝胶材料可作为生物支架、细 胞培养、药物控释、生物敷料等生物医用材料。此外，用于制备胶原基冷冻凝的 胶原，作为一种天然凝胶状蛋白具有其来源广泛，成本较低廉，低免疫原性，良 好的生物相容性和生物可降解性等优点。至目前为止，专利技术人尚未看到国内外刊 物与专利文献有关醛化多糖一胶原基冷冻凝胶研究的报道。本专利技术与已有技术相比，具有多方面的积极效果和优点，具体可归纳概括如下(1) 本专利技术提供了一种醛化多糖一胶原基冷冻凝胶及其制备工艺，制得的冷 冻凝胶材料是以胶原为主体，能充分发挥胶原的生物学性能优势。(2) 本专利技术中使用的交联剂是醛化多糖。由于醛化多糖由天然多糖经过高碘 酸钠氧化制备获得，具有无毒性、生物可降解性和组织相容性等优良的生物学性 能，采用它制备的醛化多糖一胶原基冷冻凝胶避免了游离小分子醛(甲醛或戊二 醛)造成的抑制细胞生长，产生炎症反应甚至发生钙化等代谢毒性现象，使制备 的生物材料具有更高的生物安全性。(3) 本专利技术首次在低温条件下采用生物学性能优良的醛化多糖交联胶原制 备冷冻凝胶，不仅改善了胶原基凝胶的力学性能，使其能够维持特定的三维结构 形状，而且提高了胶原凝胶热稳定性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其特征是：由从健康家畜动物皮或腱采取酶法提取得到的分子量为２８０～３２０ｋＤａ、三股螺旋结构保持完好的胶原蛋白质，经与醛化多糖交联改性反应，在模具中于０～－５０℃的低温条件下反应１～７天，出模缓慢解冻制得。

【技术特征摘要】
1.一种适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其特征是由从健康家畜动物皮或腱采取酶法提取得到的分子量为280～320kDa、三股螺旋结构保持完好的胶原蛋白质，经与醛化多糖交联改性反应，在模具中于0～-50℃的低温条件下反应1～7天，出模缓慢解冻制得。2. 根据权利要求1所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其特征 是醛化多糖与胶原的用量比例为按干重计1:1 500。3. 根据权利要求2所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其特征 是-醛化多糖与胶原的用量比例为按干重计1 : 5 100。4. 根据权利要求1或2或3所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶， 其特征是所述醛化多糖为以淀粉、透明质酸或硫酸软骨素及其衍生物为原料， 采用高碘酸钠氧化制备，醛基重量含量为30% 95%的醛化多糖。5. 根据权利要求1或2或3所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶， 其特征是所述胶原是以清洁新鲜的健康家畜动物皮或腱为原料，经丙酮脱脂、 干燥、粉碎加工成料屑，10重量份的料屑溶解在600 800重量份的0.5mol/L醋 酸溶液中，加入0.01 0.02重量份的胃蛋白酶，在5 25'C下酶解48 72h后离 心取上清液，于4 6'C下经NaCl或(NH4)2S04盐析，再经透析、冻干处理制备 得到的胶原干品。6. 根据权利要求4所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶，其特征 是所述胶原是以清洁新鲜的健康家畜动物皮或腱为原料，经丙酮脱脂、干燥、 粉碎加工成料屑，10重量份的料屑溶解在600 800重量份的0.5mol/L醋酸溶液 中，加入0.01 0.02重量份的胃蛋白酶，在5 25'C下酶解48 72h后离心取上 清液，于4 6'C下经NaCl或(NH4)2S04盐析，再经透析、冻干处理制备得到的 胶原干品。7. 根据权利要求1或2或3所述的适用于生物医用材料的胶原基冷冻凝胶， 其特征是所述醛化多糖是以10重量份的多糖加入到多糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：林炜，穆畅道，刘芳，张广照，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]