一种医用级Ⅱ型胶原的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种医用级Ⅱ型胶原的制备方法，其特点是将新鲜关节软骨作为原材料进行前处理；然后用盐酸胍抽提蛋白多糖：配制４Ｍ的盐酸胍水溶液，用碱调节ｐＨ值为６．５－７．５，将相当于上述软骨浆８－１５倍的盐酸胍水溶液倒入软骨浆中、混匀，置于摇床，摇动１－２天，离心取固体物质，经超纯水多次清洗，去除盐酸胍残液；胃蛋白酶酶解：在上述固体物质中，加入０．５－０．６Ｍ的醋酸水溶液２０００－５０００份，然后加入固体物质∶胃蛋白酶＝２０００－５０００质量比的胃蛋白酶０．１－０．３份，分两次加入，第一次加入总用量的一半，在摇床上摇动２４小时，第二次再加入另一半，再摇动２４小时，离心取上清液，加入０．０１－０．０２Ｍ的ＥＤＴＡ水溶液１－４份失活胃蛋白酶；用ＮａＣｌ盐析；用Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］水溶液透析，获得医用级Ⅱ型胶原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医用级n型胶原的制备方法，属于生物医用材料的制备领域。
技术介绍
II型胶原(Type II Collagen ， CII)是软骨基质和玻璃液中的主要有机成分。可 以加强皮肤的保水能力，填补皮肤内胶原纤维之间的空隙以及维持关节软骨的形态结 构和抗张力强度的功能，其特有的结构和化学组成使其在体内植入、药物控释载体、 组织工程支架、病理研究、药品、化妆品和食品领域得到广泛应用。近年来的研究表 明，II型胶原在类风湿关节炎和骨肿瘤的病理研究方面起着重要的作用(SnowdenN ， Reynolds I， Morgan K， et al. T cell responses to human type II collagen in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls.Arthritis Rheum, 1997,40(7) :1210和Stefan S , Christine U , John A ,et al. Arthritis - related B cellepitopes in collagen II are conformation - dependent and sterically privileged in accessible sites of cartilage collagen fibrils. J Biol Chem ,1998 ，273(3) :1551)。此外，II型胶原作为软骨组织工程支架材料， 在组织工程软骨的重建方面起着重要的作用(Nehrer S，Breinan HA，Ramappa A,et al.Canine chondrocytes seeded in type I collagen and type II collagen implants inveatigated in viro.Biomed Mater Res,1997，38(2):95-104)，国内外也有关于使用II型胶 原预防或治疗各种诱导性关节炎的研究报告(史德海，蔡道章，周长忍李立华，曾春， 李晓峰.壳聚糖与II型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究.中国修复重建外 科杂志，2005 ， 19(4)和Willers C，Chen J，Wood D，et al.Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. TissueEng,2005，ll(7-8):1065-1076.)。鉴于II型胶原的应用，尤其在体内植入方面变 的越来越重要，因此，建立一套程序较简便、产品纯度高、产量大、成本低的II型胶 原制备方法有着重要的意义。由于II型胶原与糖胺聚糖形成紧密的结合，属不溶性胶原，难以用单纯的化学方 法提取。目前国内外II型胶原的粗提方法主要是酸水解法、碱水解法和酸性条件下酶消化法；纯化方法主要有DEAE纤维柱离子交换层析法、高效液相离子交换柱层析 法和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离法。粗提方法中酸水解法和碱水解法虽然迅速彻底，但 是会破坏胶原中的氨基酸成分，而且产率低、设备腐蚀严重，产生二次污染；纯化方 法中DEAE纤维柱离子交换层析法耗时长、提纯效率低、重复性差、所提纯出的II 型胶原出现沉淀现象；高效液相离子交换层析法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法虽然保证了 所提纯胶原的质量，但是只能用于微量提纯，不适于大批生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足而提供一种医用级II型胶原的制备方 法，其特点是该方法制备的医用级II型胶原耗时短、纯度高、理化性稳定、生物活性 好、不再二次消毒灭菌，直接满足医用级生物材料的要求。本专利技术的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量 份数。医用级II型胶原的制备方法包括以下步骤1、 关节软骨的前处理将新鲜关节软骨200-300份，加入乙醇氯仿=0.5-1.5体 积比的混合溶液2000-5000份浸泡脱脂，每隔5-15小时更换一次上述溶液，15-45小 时倒掉溶液，用浓度为99%的乙醇水溶液2000-5000份浸泡，15-30分钟更换一次， 1-2小时倒掉浓度为99%的乙醇水溶液，用浓度为50-80%的乙醇水溶液2000-5000份 清洗一次，再用浓度为10-30。/。的NaCl水溶液2000-5000份浸泡，15-30分钟更换一 次，l-2小时倒掉浓度为10-30。/。的NaCl水溶液，用超纯水2000-5000份清洗2次， 再将软骨置入超纯水2000-5000份中浸泡过夜，倒掉超纯水，置入打浆机中将关节软 骨打成浆；2、 盐酸胍抽提蛋白多糖配制4M的盐酸胍水溶液，用碱调节pH值为6.5-7.5， 将相当于上述软骨浆8-15倍的盐酸胍水溶液倒入软骨浆中、混匀，置于摇床，摇动 1-2天，离心取固体物质，将固体物质用超纯水多次清洗，去除盐酸胍残液；3、 胃蛋白酶酶解在上述固体物质中，加入0.5-0.6M的醋酸水溶液2000-5000 份，然后加入固体物质胃蛋白酶=2000-5000质量比的胃蛋白酶0.1-0.3份，分两次 加入，第一次加入总用量的一半，在摇床上摇动24小时，第二次再加入另一半，再 摇动24小时，离心取上清液，加入0.01-0.02M的EDTA水溶液1-4份失活胃蛋白酶；4、 NaCl盐析将上述清液用酸调节pH值为2-2.5,加入固体NaCl至浓度为0.7-0.9M，边加边摇，加完后置于摇床，摇动30-60分钟，离心取固体物质，用0.5-0.6M 的醋酸水溶液2000-5000份溶解上述固体物质，然后用碱调节pH值为6.5-7.5;或者将上述清液调节pH值为9-9.5，加入固体NaCl至浓度为2-3M，边加边摇， 加完后置于摇床，摇动30-60分钟，离心取上清液，然后用碱调节pH值为6.5-7.5;5、 Na2HP04水溶液透析将上述溶液灌入透析袋，用0.01-0.02M的Na2HP04 水溶液2000-5000份透析92小时，48小时更换I次透析液，92小时离心收集透析袋 内固体物质；用0.5-0.6M的醋酸水溶液2000-5000份，溶解上述固体物质，使其全部溶解均匀； 用碱调节pH值为8-8.5，加入固体NaCl至浓度为2-3M，置于摇床，摇动30-60分钟，高速离心分离，取上层清液，离心机转速为8000-12000 r/min,时间为25-45min，温度为4-6。C;用酸调节上述清液pH值为7-7.5，用0.01-0.02M的Na2HP04水溶液透析92小时， 高速离心分离，取固体物质，离心机转速为8000-12000 r/min，时间为25-45miri，温 度为4-6C，获得高纯度、低抗原性、无菌、无热源、理化性稳定、生物活性好的医 用级II型胶原，产率达到15-20%。按上述方法制备得到的医用级II型胶原。医用级II型胶原用于体内植入，包括药物控释载体和组织工程支架、病理研究、 药品、化妆品、食品领域医用级II型胶原的性能测试医用级II型胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种医用级Ⅱ型胶原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：所述原料份数按重量计　　　　（１）、关节软骨的前处理：将新鲜关节软骨２００－３００份，加入乙醇∶氯仿＝０．５－１．５体积比的混合溶液２０００－５０００份浸泡脱脂，每隔５－１５小时更换一次上述溶液，１５－４５小时倒掉溶液，用浓度为９９％的乙醇水溶液２０００－５０００份浸泡，１５－３０分钟更换一次，１－２小时倒掉浓度为９９％的乙醇水溶液，用浓度为５０－８０％的乙醇水溶液２０００－５０００份清洗一次，再用浓度为１０－３０％的ＮａＣｌ水溶液２０００－５０００份浸泡，１５－３０分钟更换一次，１－２小时倒掉浓度为１０－３０％的ＮａＣｌ水溶液，用超纯水２０００－５０００份清洗２次，再将软骨置入超纯水２０００－５０００份中浸泡过夜，倒掉超纯水，置入打浆机中将关节软骨打成浆；　　　　（２）、盐酸胍抽提蛋白多糖：配制４Ｍ的盐酸胍水溶液，用碱调节ｐＨ值为６．５－７．５，将相当于上述软骨浆８－１５倍的盐酸胍水溶液倒入软骨浆中、混匀，置于摇床，摇动１－２天，离心取固体物质，将固体物质用超纯水多次清洗，去除盐酸胍残液；　　　　（３）、胃蛋白酶酶解：在上述固体物质中，加入０．５－０．６Ｍ的醋酸水溶液２０００－５０００份，然后加入固体物质∶胃蛋白酶＝２０００－５０００质量比的胃蛋白酶０．１－０．３份，分两次加入，第一次加入总用量的一半，在摇床上摇动２４小时，第二次再加入另一半，再摇动２４小时，离心取上清液，加入０．０１－０．０２Ｍ的ＥＤＴＡ水溶液１－４份失活胃蛋白酶；　　　　（４）、ＮａＣｌ盐析：将上述清液用酸调节ｐＨ值为２－２．５，加入固体ＮａＣｌ至浓度为０．７－０．９Ｍ，边加边摇，加完后置于摇床，摇动３０－６０分钟，离心取固体物质，用０．５－０．６Ｍ的醋酸水溶液２０００－５０００份溶解上述固体物质，然后用碱调节ｐＨ值为６．５－７．５；　　　　或者将上述清液调节ｐＨ值为９－９．５，加入固体ＮａＣｌ至浓度为２－３Ｍ，边加边摇，加完后置于摇床，摇动３０－６０分钟，离心取上清液，然后用碱调节ｐＨ值为６．５－７．５；　　　　（５）、Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］水溶液透析：将上述溶液灌入透析袋，用０．０１－０．０２Ｍ的Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］水溶液２０００－５０００份透析９２小时，４８小时更换１次透析液，９２小时离心收集透析袋内固体物质；　　　　用０．５－０．６Ｍ的醋酸水溶液２０００－５００...

【技术特征摘要】
1一种医用级II型胶原的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤所述原料份数按重量计(1)、关节软骨的前处理将新鲜关节软骨200-300份，加入乙醇∶氯仿＝0.5-1.5体积比的混合溶液2000-5000份浸泡脱脂，每隔5-15小时更换一次上述溶液，15-45小时倒掉溶液，用浓度为99％的乙醇水溶液2000-5000份浸泡，15-30分钟更换一次，1-2小时倒掉浓度为99％的乙醇水溶液，用浓度为50-80％的乙醇水溶液2000-5000份清洗一次，再用浓度为10-30％的NaCl水溶液2000-5000份浸泡，15-30分钟更换一次，1-2小时倒掉浓度为10-30％的NaCl水溶液，用超纯水2000-5000份清洗2次，再将软骨置入超纯水2000-5000份中浸泡过夜，倒掉超纯水，置入打浆机中将关节软骨打成浆；(2)、盐酸胍抽提蛋白多糖配制4M的盐酸胍水溶液，用碱调节pH值为6.5-7.5，将相当于上述软骨浆8-15倍的盐酸胍水溶液倒入软骨浆中、混匀，置于摇床，摇动1-2天，离心取固体物质，将固体物质用超纯水多次清洗，去除盐酸胍残液；(3)、胃蛋白酶酶解在上述固体物质中，加入0.5-0.6M的醋酸水溶液2000-5000份，然后加入固体物质胃蛋白酶＝2000-5000质量比的胃蛋白酶0.1-0.3份，分两次加入，第一次加入总用量的一半，在摇床上摇动24小时，第二次再加入另一半，再摇动24小时，离心取上清液，加入0.01-0.02M的EDTA水溶液1-4份失活胃蛋白酶；(4)、NaCl盐析将上述清液用酸调节pH值为2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋波，张焰，王文杰，朱楚洪，樊渝江，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]