AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA Marker的制备方法技术

本发明专利技术公开一种AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA?Marker的制备方法，其技术方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆转化，验证条带在DGGE胶片上的位置，制作AMF群落多样性巢式PCR-DGGE?Marker，使用NS31-GC和GloI为引物进行PCR扩增，结合序列分析结果并命名使用。本发明专利技术在AMF群落结构的Nested?PCR-DGGE研究中有重要的应用价值。可缩短实验时间，尤其适用实验样品量大的实验过程。依照本发明专利技术可以开发出一系列研究AMF群落的DNA?Marker，使得巢式PCR-DGGE技术在AMF分子群落研究中更加适用、快捷、准确。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
１．ＡＭＦ群落多样性巢式ＰＣＲ－ＤＧＧＥ检测中ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ的制备方法，其特征在于：是通过以下方法实现的：１．ａ．提取土壤ＤＮＡ，纯化ＤＮＡ样品，选用３套引物进行巢式ＰＣＲ过程，得到的第三次ＰＣＲ产物之后，－２０℃保存备用；１．ｂ．ＤＧＧＥ分析，选择胶浓度３０％－７０％，等待胶凝固完全之后，拔掉梳子，然后将整个板子安装在ＤＧＧＥ支架之上，等电泳液温度升至５８－６０℃时，将安装有板子的ＤＧＧＥ支架放入电泳槽中，用５０微升注射器快速上样，接通电源，电泳，电泳液温度为５８℃，电泳完毕，取下电泳板子，将胶条放入ＥＢ中染色１０ｍｉｎ，拍照，将电泳位置有差异的条带切下，放入无菌的ＰＣＲ小管中，编号，在无菌操作台中，向ＰＣＲ小管中加入３０μｌ无菌水，放置温度４℃，２４ｈ，使用不含ＧＣ夹板的第三对引物再次扩增，得到ＰＣＲ产物，纯化，回收，－２０℃备用；１．ｃ．克隆转化，使用北京天根生化技术有限公司的ｐＧＭ－Ｔ载体进行特异条带的克隆，转化ＤＨ５α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，使用ＮＳ３１和ＧｌｏＩ引物进行菌液ＰＣＲ，利用北京天根生化公司的ＤＰ－１０３质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒，一部分测序，一部分－２０℃保存；１．ｄ．再次验证条带在ＤＧＧＥ胶片上的位置，使用ＮＳ３１－ＧＣ和ＧｌｏＩ为引物，进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物进行ＤＧＧＥ电泳；１．ｅ．制作ＡＭＦ群落多样性巢式ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　Ｍａｒｋｅｒ，使用ＮＳ３１－ＧＣ和ＧｌｏＩ为引物，进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物按照等体积比例充分混合，３０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，－２０℃保存待用；１．ｆ．结合序列分析结果，明确ＡＭＦ群落多样性巢式ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　Ｍａｒｋｅｒ中每条带所代表的ＡＭＦ种属，并命名使用。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐明，张海涵，陈辉，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87