本发明专利技术涉及一种新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，该检测方法是采用荧光探针技术，设计一组仅在新型H1N1流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，具体包括以下步骤：(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；(2)取备检样品提取病毒RNA；(3)RT-PCR扩增；(4)质粒标准阳性模板的制备；(5)对收集的荧光曲线进行结果分析。该方法灵敏度高、特异性强，并具有良好的重复性，操作简单快速，能大大缩短检测周期，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
１．一种新型Ｈ１Ｎ１流感病毒荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（１）参照新型Ｈ１Ｎ１流感病毒ＨＡ基因序列设计特异性引物；（２）取备检样品提取病毒ＲＮＡ；（３）ＲＴ－ＰＣＲ扩增①反转录合成ｃＤＮＡ：反转录反应体系包括：１０×ＲＴ ｍｉｘ ２μｌ，２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ，２μｌ Ｒａｎｄｏｍ，Ｑｕａｎｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μｌ，５μｌ已制备的ＲＮＡ，ＤＥＰＣ水８μｌ；３７℃作用１ｈ，即反转录完成；②ＰＣＲ扩增：ＰＣＲ总体系为２５μｌ，其中１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ，２．５ｍＭ Ｍｇ２＋２μｌ，２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ，上游引物Ｈ１Ｆ－１和下游引物Ｈ１Ｒ－１各０．５μｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μｌ，模板１μｌ，余下用灭菌ｄｄＨ２Ｏ补足；反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ，然后９４℃３０ｓ，４５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，进行３０个循环，最后７２℃延伸６ｍｉｎ；反应结束后，取５μｌ ＰＣＲ产物于１％琼脂凝胶中电泳；（４）质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒：ＰＣＲ产物于１％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取ＤＮＡ，按照常规方法将目的片段与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，并转化ＤＨ５α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基３７℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液ＰＣＲ鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Ｇｅｎｅｂａｎｋ上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水１０×稀释后，在２６０ｎｍ与２８０ｎｍ波长下测定液体中质粒的含量，并计算每微升液体中质粒ＤＮＡ的拷贝数；（５）结果分析，通过ＡＢＩ７５００Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２软件分析收集的荧光曲线判定结果：提取上述阳性质粒ＤＮＡ做荧光定量标准品，倍比稀释（１０７～１０１ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）用于荧光定量ＰＣＲ标准曲线绘制，扩增反应体系２０μｌ，其中２．５×ｒｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ ８μｌ，上下游引物（Ｈ１Ｆ－２和Ｈ１Ｒ－２）各０．６μｌ，探针０．３μｌ，２０×Ｐｒｏｂｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １．０μｌ，模板２μｌ，超纯水７．５μｌ；反应条件为：９５℃１ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，６０℃１５ｓ，６８℃３４ｓ，４０个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为１０００ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴同杰，李庆雷，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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