本发明专利技术公开了一种C-末端引入半胱氨酸的葡激酶突变体。与野生型葡激酶相比，该突变体在C-末端多了3个氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。本发明专利技术还公开了该葡激酶突变体二聚体的制备方法。葡激酶的二聚体化是通过同型双功能连接剂1，4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶的C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。本发明专利技术还公开了该葡激酶突变体二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。在特定条件下，甲氧基聚乙二醇丙醛与葡激酶二聚体分子中的1个N-末端通过共价键连接。葡激酶二聚体的聚乙二醇修饰产物在生物活性方面要比葡激酶单体的修饰产物要高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质化学领域，涉及一种重组葡激酶二聚体的制备方法及其N-末端的聚乙二醇定点修饰，能够延长葡激酶在体内的循环半衰期和提高葡激酶的生物活性。
技术介绍
葡激酶(SAK)是一种含136个氨基酸的单链蛋白，相对分子量为15. 5kDa。作为新一代溶栓药物，其溶栓效力与第二代溶血栓药物组织纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogenactivator, t-PA)相当，但价格却远低于t_PA及其衍生物。目前，国内外重组葡激酶的研究都已进入III期临床试验阶段。葡激酶作为纤溶酶原(Plasminogen，Plg)的激活因子，能与Plg形成1 1的复合物，在痕量纤溶酶作用下，纤溶酶原被激活为纤溶酶， 发挥溶栓效应。葡激酶通常通过在大肠杆菌的细胞溶质中高效表达来获得。但是，由于葡激酶具有抗原性和免疫原性，并且它在体内的半衰期很短，导致葡激酶需要多次重复注射， 并且可能引发病人的不适应反应。对葡激酶进行聚乙二醇(PEG)化学修饰可以有效解决上述缺陷。PEG是一种无毒、 无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过化学反应与蛋白质和多肽等共价结合。PEG修饰可以延长蛋白质药物在血液中的循环半衰期，并且降低其免疫原性和抗原性，从而提高蛋白质药物的药效。另外，PEG修饰可以增强蛋白质药物抵抗蛋白酶水解的能力，增强蛋白质药物的水溶性并且降低肾脏对蛋白质的排泄作用。Collen等将葡激酶的Ser_3定点突变为Cys_3，Cys能与PEG-马来酰亚胺 (Mal-PEG)产生特异性反应，生成定点修饰的均一产物。葡激酶的Cys突变体SY161分别与分子量为5kDa，IOkDa和20kDa的Mal-PEG反应。PEG修饰后的SY161保持了完整的比活性、 纤维蛋白溶解能力以及人体血浆内的纤维蛋白选择性。仓鼠、兔子和AMI患者的PEG-SY161 血浆清除量随着PEG分子量的增大而降低。注射PEG-SY161后，抗体量在3_4周以后才达到中等水平，这远远低于注射野生型葡激酶。因此，PEG修饰大大的降低了葡激酶的免疫原性和抗原性，并且延长了它的循环半衰期。然而，PEG修饰同时也存在一些问题。例如，PEG修饰导致葡激酶的生物活性降低。 由于PEG为链状的大分子，它在屏蔽抗原决定簇的同时，也会干扰葡激酶与其受体纤溶酶原的相互作用，导致葡激酶的活性降低。因此，需要尝试设计和开发新的PEG修饰方法来解决上述问题，使葡激酶具有更好的药用价值。蛋白质的二聚体化可以通过增强蛋白质与其受体间的亲和力，提高蛋白的生物活性。另外，二聚体化后蛋白质的分子量成倍增加，这可以提高它在体内的循环半衰期。为制备定点结合的蛋白二聚体，通常采用基因工程为辅助手段的化学聚合方法。因此，为了使葡激酶在血液的循环半衰期延长，抗原性和免疫原性降低，并且保持较高生物活性，本专利技术将蛋白质的二聚体化和PEG修饰两种方法有效地结合起来
技术实现思路
为了降低葡激酶的抗原性和免疫原性、提高葡激酶在体内的循环半衰期和药效， 并且降低用药次数，本专利技术公开了一种在C-末端引入半胱氨酸的重组葡激酶。本专利技术还公开了该重组葡激酶的制备方法。本专利技术还公开了用同型双功能连接剂，即两端含有相同官能团的试剂，来制备重组葡激酶二聚体的方法。本专利技术还公开了该重组葡激酶二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。本专利技术的重组葡激酶突变体，与野生型葡激酶相比，在C-末端多了 3个氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。由于引入的氨基酸远离葡激酶的活性中心， 二聚体化对葡激酶的活性影响较小。本专利技术所述重组葡激酶的制备方法包括如下步骤构建重组葡激酶突变基因、突变基因与质粒连接构建表达载体、载体转化入大肠杆菌并进行高效表达、重组葡激酶蛋白的分离纯化。本专利技术采用PCR法构建的葡激酶突变基因与PET15质粒结合，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。表达产物主要集中于菌体细胞超声破碎离心后的上清液中。用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析法获得了纯化的重组葡激酶。本专利技术所述重组葡激酶二聚体的制备采用以下方案所述的同型双功能连接剂为1，4_ 二马来酰亚胺丁烷(ld-bismaleimidobutane， BMB)，其特征在于能与半胱氨酸的巯基产生特异性反应，生成硫醚键，并且在还原性条件下不会被破坏。所述的葡激酶二聚体化是通过1，4_ 二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。葡激酶二聚体的制备条件如下1)1,4- 二马来酰亚胺丁烷溶于N，N- 二甲基甲酰胺，浓度为4. OmM ；2)葡激酶浓度为0. 2-0. 3mM，所用缓冲体系为PBS缓冲液，pH 7. 4 ；3)葡激酶与1，4-二马来酰亚胺丁烷以1 0.5(摩尔比)在4°C反应过夜。本专利技术所述N-末端聚乙二醇(PEG)定点修饰的重组葡激酶二聚体(PEG-dSAK)的制备采用以下方案所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为20kDa，其特征在于能在特定条件下与葡激酶的N-末端通过共价键连接。葡激酶(SAK) 二聚体化及其PEG 化学修饰如下所示权利要求1.一种重组葡激酶突变体，其特征在于与野生型葡激酶相比，在C-末端多了 3个氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。2.根据权利要求1所述的重组葡激酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 构建重组葡激酶突变基因；突变基因与质粒连接构建表达载体；载体转化入大肠杆菌并进行高效表达；重组葡激酶蛋白的分离纯化。3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于所述的表达载体为PET15质粒。4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。5.一种重组葡激酶二聚体的制备方法，其特征在于所用重组葡激酶为权利要求1所述的重组葡激酶突变体，并用同型双功能连接剂制备葡激酶二聚体。6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于所述的同型双功能连接剂为1，4-二马来酰亚胺丁烷。7.根据权利要求5的制备方法，其特征在于所述的葡激酶二聚体是通过1，4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与2个葡激酶分子C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。8.—种N-末端聚乙二醇定点修饰的重组葡激酶二聚体的制备方法，其特征在于所述的葡激酶二聚体为权利要求5所述的重组葡激酶二聚体。9.根据权利要求8的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为 2. 0kDa-40. OkDa0全文摘要本专利技术公开了一种C-末端引入半胱氨酸的葡激酶突变体。与野生型葡激酶相比，该突变体在C-末端多了3个氨基酸，即甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸(-Gly-Gly-Cys)。本专利技术还公开了该葡激酶突变体二聚体的制备方法。葡激酶的二聚体化是通过同型双功能连接剂1，4-二马来酰亚胺丁烷的2个马来酰亚胺基团与葡激酶的C-末端的半胱氨酸形成稳定的共价键。本专利技术还公开了该葡激酶突变体二聚体实现N-末端聚乙二醇定点修饰的制备方法。在特定条件下，甲氧基聚乙二醇丙醛与葡激酶二聚体分子中的1个N-末端通过共价键连接。葡激酶二聚体的聚乙二醇修饰产物在生物活性方面要比葡激酶单体的修饰产物要高。文档编号C12N15本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组葡激酶突变体，其特征在于与野生型葡激酶相比，在Ｃ－末端多了３个氨基酸，即甘氨酸－甘氨酸－半胱氨酸（－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡涛，苏志国，马光辉，刘如艳，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：11
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