本发明专利技术涉及“融合蛋白TETPH、表达载体及其构建方法”，采用RT-PCR法克隆sTrail基因，经引物延伸法构建sTrail-uPAc-his融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a中，该表达载体经诱导成功获约38kD含载体表达标签(Trx)的融合蛋白TETPH，EK酶切该蛋白获约19.5kD的目的蛋白sTrail-uPAc。实验表明，该目的蛋白具人Trail抗原性；uPA酶可裂解sTrail-uPAc释放有活性的sTrail杀伤肺癌细胞，为让带uPA裂解序列的低活性sTrail在高表达uPA与uPAR的人体肿瘤组织其活性被释放而发挥局部杀瘤作用奠定基础，为肿瘤的治疗提供新策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是涉及融合蛋白TETPH、表达载体及其构建方法。
技术介绍
肺癌，尤其非小细胞肺癌是人类发病率及病死率最高的恶性肿瘤之一，近年来，生物技术给恶性肿瘤的治疗开辟了新途径。肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor, TNF)相关凋亡诱导配体 (TNF-relatedapoptosis inducing ligand, Trail)基因，1995 年，首次由 Wiley 等 (Wiley SR, SchooleyK, Cmolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNFfamily that induce apoptosis. Immunity,1995,16 (6) 673_821.)发现并克隆，Pitti 等(Pitti RM,Marsters SA, Ruppert S et al. Induction of apop tosis by Apo_2 ligand, anew member of the tumor necrosis factor cytokine family , J B ioChem，1996，271 (22) :12687-90.)于 1996 年也克隆到同样的基因，而命名为Apo-2L。Trail基因是第3个TNF家族分子，存在于胎盘、肺、肾、脾、外周淋巴等组织的细胞中，在诱导瘤细胞凋亡方面具重要作用。人Trail分子cDNA长ll(^bp，其分子质量为32. 5kD，编码281个氨基酸，等电点为7.63，属II型跨膜蛋白。C端(胞外区)保守性强度与!^asL和TNF相当，N端(胞内区)无信号肽，是TNF超家族成员。它的15 40位氨基酸残基为疏水区能形成跨膜结构(Falschlehner C, Schaefer U, Walczak H. Following TRAIL' s path in the immunesystem · Immunology，2009，127 O) : 145-54.)，天然状态以三聚体方式行使作用。其109位为一 N2糖基化位点，金属蛋白酶能将它从膜上切下形成可溶性肽(114 281位氨基酸)，即可溶性Trail (sTrail)。在体外，膜结合型Trail 及sTrail都可诱使多种肿瘤细胞凋亡(Ma H, Liu YX, Liu S L, et al IRecombinant adeno-associated virusmediated TRAIL gene therapy supp resses livermetastatic tumor , Int J Cancer，2005，116 :314-211.)。 sTrail 与其受体结合后启始胞内信号。 其受体有二，一是其胞浆结构域不完整或无胞浆结构域，以无功能截断形式存在，与sTrail 结合后不传递死亡信号，称诱骗受体(sTrail_R3/DCRl与sTrail-RVDCI^)；另一是具胞浆死亡结构域，与sTrail结合后，经该死亡结构域激发传递凋亡信号，使Caspase蛋白发生酶解级联反应，使细胞凋亡，称死亡受体(sTrail-Rl/DR4与Trail_R2/DR5)。大多数正常细胞表达DCRl、DCR2、DR4、DR5，瘤细胞却仅见DR4与DR5表达，正常细胞的死亡受体与诱骗受体同sTrail竞争性结合，以躲避死亡攻击。肿瘤细胞由于无诱骗受体，易受sTrail攻击而发生凋亡(Zou YX, ZhangXD, Mao Y, et al. Acute toxicity of a single dose DATR, recombinant soluble humanTRAIL mutant, in rodents and crab-eating macaques. Hum Exp Toxicol, 2010, 29 (8) :645-52.)。与其它TNF超家族成员相比，sTrail的抗肿瘤作用有如下特点更强的诱使肿瘤细胞凋亡的能力、广谱的抗肿瘤作用、对正常细胞无显著毒副作用、仅对胞核因子NF-K B有稍微激活作用、与放化疗药明显协同作用等(deBruyn M, Rybczynska AA, Wei Y，et al. Melanoma-associated Chondroitin SulfateProteoglycan(MCSP)-targeted delivery of soluble TRAIL potently inhibits melanomaoutgrowth in vitro and in vivo , Mol Cancer. 2010，23 ;9 :301.)。sTrail 在癌的治疗研究中具旁观者效应(bystander effect) (Ciusani Ε, Croci D, GelatiM et al. In vitroeffects of topotecan and ionizing radiation on Trail/Apo-L mediated apoptosis inmalignant glioma. J N eurooncol,2005,71 (1) 19-25. Huang X，Lin T, Gu J, etal. Cell to cell contact required for bystander effect of the TNF~relatedapoptosis-inducing ligand (TRAIL) gene , Int J Oncol, 2003, 22 (6) : 1241-45.)，该效应主要依赖转染胞膜表面的结合sTrail与相邻细胞表面的死亡受体结合，显示更强的杀瘤效应。可溶性 Trail分子(sTrail)，在体外它能广泛引起许多组织瘤细胞凋亡，对正常细胞却无毒副作用(Wajant H，Gerspach J，Pfizenmaier K.Tumor therapeuticby design :targeting and activation of death recep tors . Cytokine Grow th FactorReview,2005, 16(1) :55-76.Shi J，ZhengD, Liu Y et al. Overexp ression of soluble Trailinduces apoptosis in human lung adenocarcinoma and inhibits growth of tumorxenografts in nude mice. Cancer Res，2005，65 (5) 1687-92. Ciusani E，Croci D，GelatiM et al. In vitro effects of topotecan and ionizing radiation on Trai1/ Apo-Lmediated apoptosis in malignant glioma. J N eurooncol,本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．融合蛋白，其具有如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１所示氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊玮，闫国和，梁宇佳，缪殿南，戴晓天，孙慧勤，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85
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