DNA片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了DNA片段及其应用。本发明专利技术的DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。实验证明：本发明专利技术的DNA片段作为启动子能够特异地驱动下游GUS基因从单核晚期花粉中开始表达，直至花粉完全成熟。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种DNA片段及其应用。
技术介绍
我国是一个人口和农业大国，但是随着人口的日益增多，仅靠简单的农业种植模式是无法保障足够的粮食产量以满足社会需求的，生物技术才是可持续农业最重要的途径。传统的农作物育种依靠杂交育种，目前智能不育分子设计育种技术也正在不断完善， 但是，不论是传统方法还是现代技术，雄性不育系的建立在植物育种中都发挥着重要作用。 花药作为重要的雄性生殖器官，它的发育分为两部分，一部分是花药的形态建成，另一部分是花粉的形成与发育，花药的正常与否将直接影响植物的雄性育性。植物花粉发育是一个非常复杂的过程，它由个体发育的不同阶段所表达的特定基因所控制(Stinson et al., 1987 ；Mascarenhas, 1989，1990)。研究表明玉米的成熟花粉中含有两万多种mRNA分子，其中的 10%具有花粉特异性(Willing andMascarenhas, 1984 ；Schrauwen et al.，1990)。已有多种花粉特异基因被分离出来，例如油菜中的三个花粉发育早期基因(Albani et al., 1990)。目前研究较为深入的是玉米中的ZM-13 (Hanson et al.，1989)和番茄中的LAT-52 基因(Twell et al.，1989b)，ZM-13在小孢子发育晚期表达，而LAT-52在四分体时期开始表达并在小孢子发生时期表达量迅速增加。水稻是世界上重要的粮食作物，水稻的杂交优势育种具有悠久的历史，雄性不育育种的出现，极大地简化了育种程序，节省劳力，解决了其他育种不容易解决的问题，利用雄性不育制种，不仅可提高制种的质量，其产量也得到了很大的提高。但传统的不育系、恢复系和保持系的选育需要大量的杂交组合试验，具有盲目性且费时费力。花粉或花药特异启动子在植物雄性不育育种中具有重要应用价值。Mariani等(1990年)将烟草花药绒毡层特异表达基因！“四的启动子与RNAase基因构建嵌合基因，导入烟草和油菜中，获得雄性不育转基因植株，从而开创了利用植物基因工程技术获得雄性不育转基因植株的新途径。 1992年，Mariani等又把烟草花药绒毡层特异表达基因D9的启动子与RNAase抑制剂基因 barstar构建嵌合基因，转化油菜获得油菜雄性不育恢复系，与含RNAase基因的转基因雄性不育系杂交后获得可育后代。我们的研究通过分子生物学的手段完成了对水稻花药中特异表达启动子的调控元件的鉴定工作，并证明了它们的时空表达模式，明确了其在花粉发育特异时期的表达，从而在农业生产上为遗传育种的相关基础与应用研究提供一定的理论和实践指导作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA片段。本专利技术提供的 DNA 片段是从水稻(0. sativa ssp. Japonica variety iZhonghua 11’)基因组分离得到的核苷酸片段并且具有启动子活性。本专利技术中的术语“启动子”系指 DNA上一段序列，RNA聚合酶结合到该序列上，可以起始基因的转录。所述DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。本专利技术的DNA片段还包括与来自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本专利技术的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90% 或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％ )表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。含有上述DNA片段的重组载体也属于本专利技术的保护范围之内。上述重组载体是将上述的DNA片段代替pCAMBIA1301载体中⑶S基因的3 启动子后得到的重组载体。含有上述DNA片段的转基因细胞系也属于本专利技术的保护范围之内。含有上述DNA片段的重组菌也属于本专利技术的保护范围之内。上述重组菌可以是含有上述DNA片段的农杆菌。本专利技术的另一目的在于提供上述的DNA片段作为启动子的应用。上述启动子可为花粉组织特异性表达启动子。优选可为水稻花粉组织特异性表达启动子。本专利技术的又一目的在于提供上述的DNA片段在构建水稻智能两系育种中的应用。实验证明本专利技术的DNA片段作为启动子能够特异地驱动下游GUS基因从单核晚期花粉中开始表达，直至花粉完全成熟。利用本专利技术的DNA片段作为启动子可以构建不育系和恢复系基因，从而构建水稻智能两系育种。其次，本专利技术的DNA片段作为花粉特异表达启动子可为水稻及其它农作物花粉生长发育基因的功能分析及表达调控研究提供了一个有力的工具，可以配合使用该组启动子连接花粉发育功能基因，分析其表达量、表达时期与表型的关系，从而探明花粉特异基因的功能。此外，本专利技术的DNA片段作为启动子还为水稻等转基因食品的安全性研究和开发创造了有利条件，在预防转基因植物通过授粉途径发生基因漂移和延长花卉的货架寿命等方面都具有重大的应用前景。附图说明图1为PCR扩增的凝胶电泳结果。图2为⑶S载体的构建过程。图3为水稻花粉的发育过程，A、造胞细胞，B、花粉母细胞，C、四分体，D、单核早期， E、单核晚期，F、双核早期，G、双核中期，H、双核晚期，I、未成熟三核时期，J、DAPI染色未成熟三核时期花粉，K、成熟三核时期，L、DAPI染色成熟三核时期花粉。图4为水稻花粉特异性表达启动子驱动GUS表达检测结果，A、花粉母细胞时期小花，B、四分体时期小花，C、单核早期小花，D、单核晚期小花，E、双核早期小花，F、双核中期小花，G、双核晚期小花，H、成熟三核时期小花，I、单核晚期花粉粒，J、双核时期花粉，K、成熟三核时期花粉粒。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、水稻花粉特异性表达启动子的获得及其检测分析我们采用RACE方法从水稻cDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＤＮＡ片段，其核苷酸序列是如下１）或２）或３）：１）序列表中序列１所示的核苷酸序列；２）在高严谨条件下与所述１）的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；３）与所述１）的核苷酸序列具有７０％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟征，吴凤，刘源，杜晓秋，闫硕，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11