一种根结线虫生防微生物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种根结线虫生防微生物及其应用，属于微生物农药技术领域。本发明专利技术的微生物为杀线虫鞘氨醇杆菌（Sphingobacteriumnematocida）ZY-71-1菌株，于2011年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.4553。ZY-71-1菌株的16SrRNA基因序列（此序列在GeneBank数据库中的序列号为JF731241）是鉴别该菌株的主要特征依据。本发明专利技术的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂制成ZY-71-1可湿性粉剂生防菌剂。该菌剂对烟草根结线虫病有很好的防治效果。本发明专利技术的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是控制根结线虫病的高效生物农药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种根结线虫的生防微生物及其应用，属微生物农药

技术介绍
根结线虫(Meloidogynesw.)是分布最广、为害最重的植物寄生线虫，由根结线虫在全世界农作物上造成的损失高达1000亿美元(Oka Y, Koltai H, Bar-Eyal Μ, et al. 2000. New strategies for the control of plant-parasitic nematodes. Pest Manag. Sci, 56，983-988.)。根结线虫的主要种类有南方根结线虫CK i/ ⑶卵iia)、花生根结线虫CM armaria)、爪哇根结线虫CK及北方根结线虫CM Aa/^a)。烟草根结线虫病在我国烟区普遍发生，危害日趋严重，仅云南省发病面积高达40余万亩，造成烟叶减产30%-50%，已成为烟叶生产中的主要病害之一(祝明亮，雷丽萍.2008.烟草微生物学. 科学技术出版社，北京，P1-384.)。长期以来，对根结线虫病的防治主要依赖于化学防治，用吠喃丹、克线丹等剧毒或高残留的化学杀线虫剂，由于多年使用，已产生抗药性，防治效果逐年下降，而且常造成严重的环境污染、农田土壤质量退化等现象(Abawi GS, Widmer TL. 2000. Impact of soil health managements practices on soilborne pathogens, nematode and root diseases of vegetable crops. Appl Soil Ecol, 15 ⑴37-47)。由于化学杀线剂毒性强、残留高，对环境污染大，目前绝大多数化学杀线剂已被禁用。随着人类环保意识的增强，以及发展绿色烟叶、有机烟叶的需要，生物防治已经成为防控根结线虫的主导措施之ο目前，利用生防真菌开发线虫生物农药已有商业化产品，并在局部地区用于根结线虫的防治，如以厚垣轮枝霉(Verticillium chlamydosporiuni)开发的我国第一个线虫生防商品制剂“线虫必克”，以淡紫拟青霉Bhci/ms)开发的系列产品。然而，目前这类以真菌为生防菌的线虫生防菌剂存在的最大问题是防效低且不稳定。主要原因是真菌生防菌在土壤中普遍受到土壤抑真菌作用(Lockwood J L. 1977. Fungistasis in soil. Biological Reviews, 52 (1) : 1-36.)的影响，生防菌的萌发率很低，一般在0-30%之间，很少超过50%，很难在土壤中建立达到控制靶标对象所需的种群密度。这类生防菌在根际的定殖能力已经成为阻碍其产品大面积推广应用的瓶颈问题。植物内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌 (Stone J K，Bacon C W. 2000. An overview of endophytic microbes: endo- phytism defined. Bacon C W, White J F Jr. Microbial Endophytes. New York: Marcel Dekkerj P3-9)。植物内生细菌易于定殖在植物体内，相对于植物外生生防微生物，在定殖方面更具优势。
技术实现思路
3本专利技术的目的在于针对现有技术的不足提供一种根结线虫的生防微生物及其应用方法。杀线虫鞘氨醇杆菌QSphingobacterium nematocida) ZY-71-1菌株系本专利申请人从烟草红花大金元品种新鲜叶片中分离、鉴定的一种植物内生细菌新物种。该微生物通过产生活性有机挥发物毒杀线虫，在烟草根际有很好的定殖能力，该种微生物对根结线虫的生防特性和效果未公开报道。本专利技术从烟草内生菌中筛选具有工业化生产前景的菌株， 为烟草农业生产中根结线虫的防治提供一种具有较好防治效果的生防微生物。本专利技术的根结线虫生防微生物是杀线虫鞘氨醇杆菌iSphingobacteriim nematocida) ZY_71_1菌株，该菌株已于2011年1月14日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101，保藏号CGMCC No. 4553。Sphingobacterium nematocida ZY-71-1菌株在牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g， 蛋白胨10g, NaCl 5g，琼脂20g，补水至1000ml, pH6. 8)上，菌落呈黄色，圆形，表明湿润，边缘凸起，细胞为杆状，直径0.4-0. 8 μπι，*1.0-1.5 μ m，孢子不游动，革兰氏阴性。该菌株在10° C至40° C的温度范围内生长，最适生长温度37 ° C;在pH 6.0到9.0的范围内可以生长，最适生长PH为7.0 ；可以在浓度为0-3 % WNaCl (w/v)范围内生长，最适生长的 NaCl 浓度为 0-1%。利用引物 5，- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，，5，_AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’经PCR扩展该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为JF731241，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。利用本专利技术的ZY-71-1菌株可用于制备防治烟草根结线虫病菌剂，该菌剂为可湿性粉剂，是通过以下方法制备的经培养获得的ZY-71-1菌体及其代谢物作为原药与适量的硅藻土、木钠、K12、蔗糖、海藻酸钠混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于5%，粉碎后制成可湿性粉剂，菌剂需保证ZY-71-1的活菌数含量在1 X IO9个/g以上。利用ZY-71-1菌株制备的可湿性粉剂对防治烟草根结线虫病有很好的防治效果。 能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期。施用时可将ZY-71-1菌剂与烟草育苗基质混合使用，也可在移栽时施入烟草根际周围，或在成熟期兑水灌根。对病害发生严重田块，移栽期和成熟期分别施用一次效果最好。^M SphingObacterium nematocida ZY-71-1菌株制备的生防菌剂具有成本低、 防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治根结线虫病的高效生物农药。具体实施例方式1.本专利技术中ZY-71-1的培养及菌剂制备ZY-71-1菌株试管斜面种子培养将该菌株的菌体接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，15-40°C下培养1-5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是37°C下培养2天。ZY-71-1菌株液体种子的培养将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基不添加琼脂)中，15-40°C，50-350 rpm条件下摇床培养 2-7天。最适培养条件为37°C，200rpm条件下培养3d。ZY-71-1菌株在发酵罐中的大量培养将液体种子按1-5% (V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在温度^-40°C，搅拌速度150 - 250rpm，发酵时间2_3d。ZY-71-1菌株可湿本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种根结线虫生防微生物，其特征在于：所用的生防微生物为杀线虫鞘氨醇杆菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ）ＺＹ－７１－１菌株，该菌株２０１１年１月１４日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．４５５３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：奚家勤，尹启生，宋纪真，薛超群，王广山，周汉平，王建伟，张仕祥，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：41