一个高喹啉降解基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个对喹啉具有高降解性的新基因purD1。实验证明，将purD1基因转化微生物能使该微生物获得对喹啉的降解活性。purD1及其编码蛋白赋予微生物的降解活性最大降解浓度能够达到850mg/L。本发明专利技术对喹啉类污染物的治理具有非常重要的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一个高喹啉降解基因及其应用
技术介绍
喹啉是含氮杂环化合物的典型代表，用途极其广泛，是多种医药、农产品、染料等生产中的重要原料和溶剂。但是喹啉及其衍生物可致癌、致畸、致突变，且难于生物降解，是环境中的严重污染物。环境中的喹啉主要来自煤气、化石燃料加工、煤焦油残余物和木材保存设施。此外，喹啉及其衍生物还是焦化废水、石油废水、制药废水等多种工业废水中的难降解有机污染物成分。有学者分别对2种焦化废水的有机物组成进行了分析，指出喹啉类化合物的含量居有机污染物的第二。由于喹啉含有1个电负性很强的氮原子使得其水溶性增强，因此这类化合物更易在环境中扩散和持久存在。已有调查发现在木馏油污染场所附近的地下水和土壤中喹啉及其羟基喹啉的浓度高达数个mg/L。除此之外，喹啉及其衍生物还存在于城市空气、烟草烟雾、海水和鱼的组织中，因此寻找有效去除喹啉的方法具有十分重要的意义。污染物的去除方法很多，大致分为物理法、化学法和生物法。物理法和化学法虽然去除效率高，但是成本高，容易产生二次污染。生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，现已成为污染治理技术中的首选方案之一。决定生化处理工艺成功、有效、适用的因素，除了工艺条件和操作管理外，用于污染物降解、转化等过程的功能基因的重要作用也是显而易见的。喹啉降解途径主要分为有氧代谢和厌氧代谢，其降解途径多种多样，但是对于喹啉降解特性及降解途的研究还停留在理论阶段。由于喹啉本身属于难降解有机杂环化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，因此，克隆能够稳定有效降解喹啉的基因是工作量更为巨大且困难的事情。目前对喹啉降解基因知之甚少，无法提供序列上的参考和方法上的借鉴，无法预测喹啉降解基因，只能通过工作量惊人的筛选和验证，实际很难完成。本专利技术人经过长期的大量而艰苦实验筛选和验证，意外地发现了一个具有高喹啉降解能力的新基因，该高喹啉降解能力还可以用于多种微生物，具有非常广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供对喹啉具有高降解性的新基因，该基因编码下述(a)或 (b)所代表的蛋白质(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)、与SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予高喹啉降解活性的蛋白质。编码上述(a)所述的蛋白质的基因是编码由SEQ ID No :2代表的氨基酸序列组成的赋予高喹啉降解活性的蛋白质的基因(命名为purDl)。purDl是从恶臭假单胞菌 (.Pseudomonas ^wiiVa) KT-ql-116中克隆得到的。KT-ql-116为本专利技术人从北京市肖家河污水处理厂活性污泥中经初筛和复筛等大量的实验得到的对喹啉具有高降解活性的恶臭假单胞菌，该菌株已于2008年12月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通卫生中心，保藏号为CGMCC No. 2790。目前报道的喹啉降解最大浓度为500mg/L，本专利技术的purDl及其编码蛋白赋予微生物的降解活性不仅能够降解500mg/L的喹啉，最大降解浓度能够达到850 mg/L。本专利技术对喹啉类污染物的治理具有非常重要的实际应用价值。本专利技术使用的“高喹啉降解”术语是指对喹啉的降解浓度高于500mg/L，优选降解浓度为500mg/L 850 mg/L，更优选浓度为700 mg/L 850 mg/L。编码上述(b)所述的蛋白质的基因是编码这些蛋白质的基因，这些蛋白质与SEQ ID No 2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸(比如1-5或 1-12个)的氨基酸序列组成，且赋予高喹啉降解活性。在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得编码本专利技术(a)或(b)氨基酸序列的核苷酸序列。另外，可通过如定点诱变技术等合成与突变体具有相同功能的本专利技术的突变体基因。本专利技术的另一个目的是提供了一种获得具高喹啉降解活性的微生物的方法将本专利技术的基因或含有本专利技术基因的重组体导入微生物，使其具有高喹啉降解活性。本专利技术所述的重组体是指包含根据本专利技术基因的重组载体。通过将根据本专利技术的基因导入合适的载体获得根据本专利技术的重组载体。上述重组载体还包含外源基因或外源 DNA片段。用于插入根据本专利技术基因的载体不受任何的限制，只要该载体可以在宿主中复制，优选为本领域常用的克隆载体和表达载体。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本专利技术范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1是pBBRlMCS-purDl转化突变体D得到高喹啉降解菌株。KT_ql_116是正对照，广8为Dp广8，E为突变体E，作为负对照。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中的溶剂均为水，具 nT#jAL ((Molecular Cloning: A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell,David W. ,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。MM2 降解培养基=Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1 g/L，微量元素液 5. 0ml/L ；其中每 1000ml 微量元素液包括 CaCl2 · 2H20 0. 0004g, FeSO4 · 7H20 0. 04g, MnSO4 · 4H20 0. 04g, ZnSO4 · 7H20 0. 02g, CuSO4 · 5H20 0. 005g, CoCl2 · 6H20 0. 004g, NaCl 1. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 005g。灭菌冷却后添加喹啉终浓度为300mg/L。1/10LB固体培养基酵母粉0.5g/L，蛋白胨1 g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L ；灭菌后冷却至60°C后添加喹啉终浓度为200mg/L。LB液体培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。如需要，在以上培养基中添加相应的抗生素。卡那霉素终浓度5(^g/ml，庆大霉素终浓度30μβ/πι1。实施例1、高喹啉降解基因purDl的获得一、降解菌/^ewi/offloaas putida KT-ql-116 Tn5突变体文库的建立 本专利技术人从北京市肖家河污水处理厂活性污泥中经初筛和复筛等大量的实验得到的对喹啉具有高降解活性的恶臭假单胞菌KT-ql-116，应用Tn5转座复合体技术建立细菌转座突变体文库的方法克隆高喹啉降解基因purDl。Tn5 Transposome是购自Epicentre公司的 EZ: :TN<Kan_2>Tnp Transposome Kit。1.降解菌Aei/i/offloaas putida KT-ql-116电转化感受态的制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．编码下述（ａ）或（ｂ）的蛋白质的基因：（ａ）、由ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及（ｂ）、与ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予喹啉降解活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
2010.05.20 CN 201010177727.91.编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因(a)、由SEQID No :2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及(b)、与SEQID No :2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏勉，徐海英，乔琳，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11