用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物和使用所述组合物通过多重实时PCR来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含：(i)靶向IS6110的引物和/或探针，所述IS6110为结核分枝杆菌复合群-特异性基因；(ii)靶向rpoB的引物和/或探针，所述rpoB为分枝杆菌属-特异性基因；和视需要的(iii)作为内对照的靶向植物源基因的引物和/或探针。当使用本发明专利技术的组合物进行多重实时PCR时，可以通过单轮PCR测定检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。因此，本发明专利技术实现了具有高可靠性的快速且容易的临床诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosis complex)或分枝杆菌属(Mycobacterium genus)的组合物和一种使用所述组合物通过多 重实时PCR来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法。更具体地说，本专利技术涉 及一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，所述组合物包含(i)靶向 IS6110的引物和/或探针，所述IS6110为结核分枝杆菌复合群特异性基因；(ii)靶向rpoB 的引物和/或探针，所述rpoB为分枝杆菌属特异性基因；和视需要的(iii)作为内对照的 靶向植物源基因的引物和/或探针。
技术介绍
结核是自古以来世界上导致死亡的主要传染病。结核的成因性细菌病原体是致结 核细菌，所述致结核细菌属于分枝杆菌属并且具有杆状(杆菌)形态，其厚度为0. 2-0.5μπι 并且长度为1-4 μ m。分枝杆菌属涵盖导致人类和动物的呼吸道疾病(包括结核)、麻风(韩森氏病 (Hansen ‘ s disease))等的各种病原性物种。目前为止，已经识别出大于100种分枝 菌物禾中(Shinnick TM et al. , Mycobacterial Taxonomy. Eur JClin Microbiol Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。已知结核分枝杆菌是导致人类结核的主要菌株。人类结核的罕见病例是由牛分枝 杆菌(Mycobacterium bovis)所致。已知麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)会导致 麻风病，艮韩森氏疾病(Shinnick TM andGood RC. ,Mycobacterial Taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。在经济欠发达的国家，结核是疾病和死亡的主要原因之一。在韩国，估计每年有 120，000人感染结核病原体。根据2004年韩国国家统计局(Korea National Statistical Office, KNS0)的统计数据，在2003年的调查中，新结核患者的发病率多达30，687例(每 100，000人中64例)，而且就结核死亡率而言，韩国在30个OE⑶成员国中不体面地排名最高。近年来，归因于感染AIDS或其他免疫缺陷患者或免疫受损婴儿受非结核性分枝 杆菌(NTM)感染，显示类似于结核感染临床症状的非典型结核病例的发病率正稳定增长。非结核性分枝杆菌(NTM)的实例可以包括鸟分枝杆菌胞内复合群 (M. avium-intracellulare complex)或鸟分枝杆菌复合群(M. avium complex)、偶发分枝 杆菌(M. fortuitum)、龟分枝杆菌(M. chelonae)、戈登分枝杆菌(M. gordonae)、苏尔加分枝 杆菌(M. szulagai)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、非洲分枝杆菌(M. africanum)和日内 瓦分枝杆菌(M. genavense) (Barnes PFet al. , Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 1991 ；324 (23) :1644-1650)。上述例示的NTM的多种细菌菌株对于抗结核药显示多重耐药性，这使得难以对 结核取得有效疗效(Kam KM et al. , Trends inMultidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum SmearPositivity in Hong Kong,1989-1999. Clin Infect Dis. 2002 ；34 (3) :324-329) 具体地讲，与结核菌相比，已知鸟分枝杆菌胞内复合群或鸟分枝杆菌复合群(MAC) (其是最常见的NTM物种)对一线抗结核药显示十到一百分之一的较低敏感性。为此，美 国胸科学会(American Thoracic Society, ATS)提出一种用于诊断和治疗NTM疾病的方 ft(美 15月匈禾斗学I，Diagnosis andtreatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir CritCare Med. 1997 ；156(2) :S1_S25)。也就是说，NTM疾病的病原性症状十分类似于结核感染，但用于治疗这两种疾病的 治疗性药物彼此间可能完全不同。为了提供对应于受结核或非结核分枝杆菌感染的个别 患者的合理治疗方案，有必要尽早且准确地检测和诊断所关注患者的结核和非结核分枝杆 菌。诊断结核的传统方法可以包括患者临床症状的检查、结核菌素皮肤测试、X射线照 相术和细菌学测试。虽然结核菌素皮肤测试是用于辨别受结核感染的患者的最简单的手 段，但缺点是由于严重结核、麻疹(风疹)和免疫抑制而在无反应性诱导条件下可能经常产 生假阴性结果。此外，X射线诊断的效能由读取者的能力决定，并且平均25%的由X射线检 查诊断为阳性的患者经其他诊断测试诊断为阴性。因此，由X射线照相术来诊断结核取决 于得到异常阴影和读取者对所述异常阴影的准确判读。细菌学测试(S卩，结核菌的检测)是诊断结核感染的可靠方法，并且可以包括涂片 测试、培养测试、分子诊断测试等。涂片测试通常使用萋-尼氏染色(Ziehl-Neelsen staining)，萋-尼氏染色是用 于辨别耐酸有机物(主要为分枝菌)的一种特殊技术。虽然萋-尼氏染色是简单且快速的 诊断技术，但难以辨别结核和非结核性分枝杆菌，而且检测灵敏度也低。培养测试有利地提供用于准确诊断和辨别结核菌的高检测灵敏度。也就是说，即 使在约10个细菌/毫升测试样本的极低浓度下，仍可以检测病原菌。遗憾地是，由于需要 约4-8周的长期培养和由良好培训的专业人员检查以得到测试结果，因此这种方法在疗法 上并不有利于治疗结核患者。BACTEC方法(Becton Dickinson，美国)是一种用于诊断结核的新颖方法，其通 过放射性同位素来测量由接种到含有C14-棕榈酸酯的液态介质上的细菌新陈代谢产生的 wCO2的量并且将所测量的量表示为生长商数。该方法平均要花16天来取得结果。然而，问 题在于，需要各种措施和技术人员来安全处理和管理放射性同位素。基于电泳的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种能够在 2-3小时的短时期内通过放大特异性基因区域迅速且准确地诊断结核的方法。PCR测定 是一种有用的技术，其实现了在一天内以高灵敏度和95%或更高的特异性来检测临床样 本中的结核菌(Wilson SM et al. , Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application todiagnosis of tuberculosis. J 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于检测结核分枝杆菌复合群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｃｏｍｐｌｅｘ）或分枝杆菌属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｅｎｕｓ）的组合物，其包含：选自由以下各者所组成的群组的至少一种引物：含有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中所述的碱基序列的引物；含有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２中所述的碱基序列的引物；含有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３中所述的碱基序列的引物；和含有如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４中所述的碱基序列的引物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex)或分 枝杆菌属(Mycobacterium genus)的组合物，其包含选自由以下各者所组成的群组的至 少一种引物含有如SEQ ID NO 1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO 2中所述 的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO 3中所述的碱基序列的引物；和含有如SEQ ID NO 4中所述的碱基序列的引物。2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含内对照引物。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述内对照引物是植物源基因-特异性引物。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述植物源基因是凝集素基因并且所述植物源 基因-特异性引物为含有如SEQ ID NO :28中所述的碱基序列的引物或含有如SEQ ID NO 29中所述的碱基序列的引物。5.一种用于检测结核分枝杆菌复合群的组合物，其包含含有如SEQ IDNO :1中所述的 碱基序列的正义引物和/或含有如SEQ ID NO :2中所述的碱基序列的反义引物作为对结核 分枝杆菌复合群的IS6110基因具有特异性的引物。6.一种用于检测分枝杆菌属的组合物，其包含含有如SEQ ID NO :3中所述的碱基序列 的正义引物和/或含有如SEQ ID NO :4中所述的碱基序列的反义引物作为对分枝杆菌属的 rpoB基因具有特异性的引物。7.根据权利要求6所述的组合物，其中对所述分枝杆菌属的所述rpoB基因具有特异性 的所述引物形成长度小于IOObp的PCR扩增产物。8.一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含选自由以下各者组成的群组的至少一种探针含有如SEQ ID NO :5中所述的碱基序列 的探针；含有如SEQ ID NO :6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO :7中所述的 碱基序列的探针。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述探针在其5'端和3'端标记有荧光染料， 并且5'-标记的荧光染料(报道剂)和3'-标记的荧光染料(淬灭剂)彼此间显示出 相互干扰。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述5'-标记的荧光染料选自由以下各者 组成的群组6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花 青-5(Cy5)，并且所述3'-标记的荧光染料是6-羧基四甲基-罗丹明(TAMRA)或黑洞淬 灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)。11.一种用于通过实时PCR分析结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含选自由以下各者组成的群组的至少一种引物含有如SEQ IDNO 1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO :2中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO :3中所述的碱 基序列的引物；和含有如SEQ ID NO 4中所述的碱基序列的引物；和选自由以下各者组成的群组的至少一种探针含有如SEQ IDNO 5中所述的碱基序列 的探针；含有如SEQ ID NO 6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO 7中所述的 碱基序列的探针。12.根据权利要求11所述的组合物，其进一步包含内对照引物和内对照探针。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述内对照引物是含有如SEQIDNO 中所 述的碱基序列的正义引物或含有如SEQ ID NO 中所述的碱基序列的反义引物，并且所述内对照探针是含有如SEQ IDNO 30中所述的碱基序列的探针。14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物包含(i)结核分枝杆菌复合群IS6110-特异性引物和探针混合物，其包含含有SEQID NO 1的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO :2的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO 5的碱基序列的探针；(ii)分枝杆菌属rpoB-特异性引物和探针混合物，其包含含有SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜镇锡，朴荣石，李在成，
申请(专利权)人：株式会社LG生命科学，
类型：发明
国别省市：KR