编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用制造技术

调节烟碱类生物碱生物合成途径的转录因子可以调控植物代谢及生物碱水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码调节生物碱合成之转录因子的核酸序列及其在改良植物代谢中的应用临 时专利申请之权益本专利技术要求我们于2007年5月25日所申请美国临时专利60/924，675之权益。 专利
本专利技术与调节植物代谢的转录因子相关，亦与编码这些转录因子的核酸分子相关。除与其它事项相关外，该专利技术亦与编码这些转录因子的核酸序列相关，这些转录因子调节烟草植物生物碱的生成，尤其是，但不完全是，烟草植物烟碱的生成，该专利技术亦与生产生物碱含量已改变的植物和细胞相关。专利技术背景资料多种植物天然产物因其拥有生物学活性而被用作药物，这些植物也因此具有价值，尤其是生物碱这一类天然产物，其作为药物的用途已被证实。具有生物学活性的生物碱的例子包括吗啡，东茛菪碱，喜树碱，古柯碱及烟碱。这些化合物均从植物提取而用作药物。 烟碱，吗啡(及相关的阿片类药物)及古柯碱是成瘾类药物，在全世界导致严重的健康和社会问题。烟碱是具有一系列生物学活性的吡咯烷类生物碱，这些活性包括强烈的毒性作用以及神经系统刺激作用。烟碱在烟草和本塞姆氏烟草以及若干其它物种的根部合成， 而后被运送至叶部，似乎在那里起防御作用。一类具有挥发性叫做茉莉的植物激素可以诱导烟碱以及许多其它植物代谢物的合成(Gundlach等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 2389-2393(1992))。虽然通过植物损伤或使用茉莉可以增加烟碱的含量，调节诱导现象的实际成分仍有待发现。植物天然产物的生物合成主要受转录调控，植物可以通过这种机制以发育和应激特异的方式调节代谢。已在植物中发现若干调节次级代谢途径的转录因子。一组相互作用的MYB蛋白(例如，玉蜀黍Cl及拟南芥ΡΑΡ1/ΡΑΡ2)和碱性螺旋-环-螺旋蛋白(例如，玉蜀黍R及矮牵牛ANl)控制花青素的生物合成(文献回顾见Vom Endt等，Phytochemistry 61 :107-114(2002))。调节植物代谢过程的其它转录因子包括可能控制棉花表皮毛倍半萜合酶转录的WRKY类型的转录因子(Xu等，植物Physiol. 135 =507-515(2004))以及拟南芥中上调植物蜡生物合成的AP2/ERF类转录因子Wim (Broun等，Curr. Opin.植物Biol. 7 202-209(2004))。在长春花细胞悬液超表达CA3可增加长春花萜类吲哚生物碱代谢途径中部分酶基因的转录水平，但是只有在该细胞悬液中加入一种萜类前驱物马钱苷时才会观察到生物碱的聚集(van der Fits 及 Memelink，Science 289:295-297(2000))。超表达 Nt 或 Cl 以及NtJAPl两个转录因子可以在细胞悬液中增加与N-甲基腐胺氧化酶(PMT)启动子联锁的标记基因的瞬时表达(De Sutter 等，Plant J. 44 1065-76 (2005))。专利技术概要在一方面，本专利技术提供一个分离的核酸分子，其核苷酸序列由下列组成 (a)序列 1(SEQ ID NO :1)，序列 2 (SEQ ID NO :2)，序列 4 (SEQ ID NO :4)，序列 5 (SEQ ID NO :5)，序歹Ij 6 (SEQ ID N0:6)，序列8(SEQ ID NO :8)，序列 9 (SEQ ID NO :9)，序列 11 (SEQ ID NO: 11)，序列 12 (SEQ ID NO :12)，序列 14 (SEQ ID NO 14)或序列 15 (SEQ ID NO 15)所含核苷酸序列； (b)本核苷酸序列编码多肽分子，其氨基酸序列包含在序列3 (SEQ ID N0:3)，序列7(SEQID NO 7)，序列 10 (SEQ ID NO 10)，序列 13 (SEQ ID NO 13)或序列 16 (SEQ ID NO: 16) ； (c)本核苷酸序列与(a)或(b)所含核苷酸序列至少90%相同，并编码调节生物碱生物合成的转录因子；(d)本核苷酸序列与(a)，(b)或(c)所含核苷酸序列在严格条件下杂交，并编码调节生物碱生物合成的转录因子。在一个涵义上，经遗传工程生成植物细胞，该细胞含有由至少21个连续核苷酸组成的核酸序列，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列。在深一层涵义上，植物由植物细胞构成。在另一涵义上，组织培养由组织细胞组成，所说的组织培养生成或分泌至少一种生物碱， 生物碱前驱物，或生物碱类似物的能力增加。在深一层涵义上，有方法从组织培养生成生物碱，生物碱前驱物，或生物碱类似物，该方法包括从组织培养分离所说的生物碱，生物碱前驱物，或生物碱类似物。在更深一层涵义上，组织培养由菸草植物细胞组成，例如，烟草。在另一方面，本专利技术提供调节生物碱合成的重组转录因子，其氨基酸序列由下列序列组成(a)序列3，7，10，13，或16所编码的氨基酸序列；及(b) (a)中编码的氨基酸序列之变异序列。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法提供生物碱含量降低的植物。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植物。在另一方面，这里提供一种减少植物中生物碱含量的方法，该方法包括下调正性调节生物碱合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式下调转录因子(a)在该植物中引入由至少21个连续核苷酸组成的核酸序列，该序列从序列1，5， 8或11中选出，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列；(b)与相似条件下生长的对照植物相比，在所说的核苷序列减少植物转录因子的条件下生长该植物。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法减少植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植物。在另一方面，本专利技术提供减少植物群体生物碱含量的方法，包括(a)提供含有异变的植物群体；(b)在所述植物群体中检测含有定向异变的植物，与对照植物相比，所说的含有定向异变的植物其正性调节生物碱合成的转录因子表达下降；(c)与相似条件下生长的对照植物相比，选择性培育有定向异变的植物以生成正性调节生物碱合成转录因子表达下降的植物。在一个涵义上，所述检测方法利用根据序列1，5，8或11设计的引物从异变植物中放大该转录因子基因区，并通过与野生型植物基因相应区域比较，在含有异变的植物中确定导致正性调节生物碱合成的转录因子表达下降的基因错配区域，并确定含有基因错配的植物。在一个涵义上，该生物碱是烟碱类生物碱。在深一层涵义上，该烟碱类生物碱是烟碱。在另一涵义上，该植物属于烟草属植物。在深一层涵义上，该植物是烟草。在另一涵义上，该方法减少植物中生物碱含量。在深一层涵义上，生物碱含量减少的产物来自于生物碱含量减少的植物。 在另一方面，本专利技术提供减少植物中生物碱含量的方法，包括上调负性调节生物碱合成的转录因子。在一个涵义上，可以通过下列方式上调转录因子(a)在该植物中引入一表达载体，后者含有从序列4，14，或15中选出的核苷序列，所说的连续核苷酸以正义或反义方向排列；本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５中的核苷酸序列；（ｂ）编码具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６中的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；（ｃ）与（ａ）或（ｂ）的核苷酸序列至少９０％相同并编码调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列；（ｄ）与（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的核苷酸序列在严格条件下杂交并编码调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2007.05.25 US 60/924,6751.一种分离的核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列(a)SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO : 15 中的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 16中的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(c)与(a)或(b)的核苷酸序列至少90%相同并编码调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列；(d)与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列在严格条件下杂交并编码调节生物碱生物合成的转录因子的核苷酸序列。2.一种调节生物碱生物合成的重组转录因子，该因子具有选自以下的氨基酸序列(a)SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:13 或 SEQ IDNO :16 中的氨基酸序列 ’及(b)(a)中的氨基酸序列的变体。3.一种基因工程植物细胞，其包含权利要求1的核酸序列的至少21个连续的核苷酸， 其中所说连续的核苷酸以正义或反义方向排列。4.一种包含权利要求3的植物细胞的植物。5.一种减少植物中生物碱含量的方法，其包括下调正调节生物碱生物合成的转录因子。6.权利要求5的方法，其中通过下列方式下调转录因子(a)在植物中引进包含i)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 11的序列的至少21个连续核苷酸的核酸序列，其中所说述连续核苷酸以正义或反义方向排列；及(b)在相比于在相似条件下生长的对照植物所述核苷酸序列降低植物中转录因子含量的条件下使所述植物生长。7.一种减少植物种群中生物碱含量的方法，其包括(a)提供突变植物的种群；(b)在所述种群内检测及选择靶突变植物，其中与对照植物相比，所述靶突变植物的正调节生物碱生物合成的转录因子的表达下降；及(c)选择性育种该靶突变植物以产生与对照植物种群相比正调节生物碱生物合成的转录因子表达减少的植物种群。8.权利要求7的所述方法，其中所述检测包括利用根据SEQID N0:USEQID NO :5、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :11设计的引物从突变植物种群的突变植物中扩增转录因子基因的区域；确定导致正调节生物碱生物合成的转录因子基因表达下降的、扩增区域和野生型基因相应区域之间的错配；并确定含有该错配的突变植物。9.一种减少植物中生物碱含量的方法，其包括上调负调节生物碱生物合成的转录因子。10.权利要求9的方法，其中通过下列方式上调转录因子(a)在植物中引进含有选自SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:14或SEQ ID N0:15的核苷酸序列的表达载体；及(b)在相比于在相似条件下生长的对照植物所述表达载体增加植物中转录因子含量的条件下使该植物生长。11.权利要求5-10的任何一项的方法，其中所述生物碱是烟碱类生物碱。12.—种减少植物中烟碱类生物碱的方法，其包括下调正调节生物碱生物合成的转录因子以及下调肌81、々622、0 1\ ]^及1^0中的至少一个。13.一种减少植物中烟碱类生物碱的方法，其包括上调负调...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳森·佩奇，安德莉亚·T·托德，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：CA