本发明专利技术公开了一种orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂，所述orexin-A载药脂质体的制备方法包括下述步骤：a.将orexin-A多肽准确称量，用磷酸盐缓冲液配制成20μg/ml的orexin-A原液；b.称取一定量的卵磷脂、胆固醇、膜材PEG2000-DSPE，溶解于三氯甲烷中得到混合液；c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；d.蒸干物中滴加磷酸盐缓冲液，制得水性混悬液；e.用对水性混悬液超声3～5min，冷至室温；将步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0.45μm滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。对该orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即得治疗发作性睡眠的鼻喷剂：将该鼻喷剂溶于生理盐水中即得静脉注射剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人工合成oreXin-A(食欲素A)载药脂质体的制备方法，以及含有所得载药脂质体的用于治疗发作性睡眠的两种常用药剂。
技术介绍
发作性睡眠病是以不可抗拒的短期睡眠发作为特点的一种疾病，多发生于儿童和青春期的青少年，成年人偶有发生。大多数学者认为，该病是由于睡眠介质紊乱引起，部分病人有脑炎和颅脑外伤史。也可以发生在免疫功能低下、脑肿瘤、多发性硬化或者情绪紧张之后。约有10% 30%的病人有家族遗传史，多数病人没有明显的诱因。发作性睡眠的发病病因尚未完全明确，但最近有学者提出自身免疫假说。研究发现，发作性睡眠和HLA—些基因变化存在着相关性，HLA的复杂多样性可以增加机体自动免疫反应的能力，从而使下丘脑神经元产生一种名为食欲素的蛋白质，其作用是控制食欲和睡眠。而患有发作性睡眠的病人，其下丘脑内能产生食欲素的神经元明显降低。治疗发作性睡眠要根据个人症状和治疗反应，治疗可能需要数月或者更长的时间，药物要经常进行调整。目前发作性睡眠的主要治疗方案是口服安非他明、甲基苯丙胺或者莫达非尼。Orexin-A是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节摄食、睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能。1998年Yanagisawa等在大鼠下丘脑腹外侧发现了两种与食欲有关的神经肽，命名为orexin-A(食欲素-A)和orexin-B(食欲素-B)。 近年来有多项研究证实orexin系统功能受损可导致多种神经系统疾病的发生，例如睡眠障碍、急性颅脑损伤、蛛网膜下腔出血等。有研究发现，发作性睡眠的发生是由于下丘脑内 orexin蛋白质表达降低所导致。因此，我们推测用脂质体包裹神经多肽orexin-A可治疗发作性睡眠。目前国际上在使用orexin治疗中枢神经系统疾病时大部分还仅限于脑室给药， 然而这种给药方式易引起损伤和感染，给临床应用带诸多不便，限制了其在临床上的应用。
技术实现思路
为解决orexin-A治疗中脑室给药所存在的问题，本专利技术的目的是提供一种采用脂体包裹orexin-A的制备工艺，可以得到纳米级orexin-A脂质体，使载药脂质体更易穿透血脑屏障，增加其脑组织药物摄入量，增加orexin-A在体内的稳定性，达到了较好的疗效。为达到以上目的，本专利技术是采取如下技术方案予以实现的—种orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤a.将orexin-A多肽准确称量，用pH为7. 2-7. 6的磷酸盐缓冲液PBS，配制成 20 μ g/ml 的 orexin-A 原液；b.称取400mg卵磷脂、160mg胆固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于100ml三氯甲烷中得到混合液； c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发； d.蒸干物中滴加IOml磷酸盐缓冲液PBS，制得水性混悬液；e.用对水性混悬液超声3 5min，冷至室温；f.将IOml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌30min，0. 45 μ m滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。上述方法中，所述步骤a中，orexin-A多肽可采用商售的产品(美国Tocris公司， No. 1455)，也可采用本专利技术自制的orexin-A多肽，其制备方法包括以下步骤；(1)将Ig的Rink-MBHAresin树脂用IOml的DMF溶液溶胀40分钟；(2)将溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF溶液洗涤三次；(3)洗涤后的Rink-MBHAresin树脂加入IOml的DMF溶液反应20分钟；(4)在步骤(3)反应后的溶液中加入3倍于溶液质量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液质量的HOBT和DIC，以及IOml的DMF溶液，反应45分钟，得到连接有多肽分子的树脂；(5)将步骤(4)连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗，冻干后用95%三氟乙酸溶液浸泡1 2小时，将树脂上的多肽分子切掉；将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预冷的乙醚中，得到白色沉淀即为还原型orexin-A多肽；(6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0. 5-lmg/ml的量加入PH值为7. 2-7. 6的磷酸盐缓冲液PBS中，并用的H2A氧化，12-36小时后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。本专利技术的另一目的是提供两种治疗发作性睡眠的常用药剂，其中之一为鼻喷剂， 该鼻喷剂的特征在于对本专利技术前述方法所得的orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即可。 另一种为静脉注射剂，该静脉注射剂的特征在于对经冷冻干燥所得鼻喷剂，将其溶解于生理盐水中即可临床使用。与现有莫达非尼作为已知的治疗发作性睡眠的药物相比，通过动物实验，本专利技术的优点在于1、在制备工艺中可通过分次载药提高载药率，通过超声处理和滤膜过滤相结合降低脂质体粒径，可以得到纳米级orexin-A脂质体。2、采用本专利技术脂质体包裹orexin-A可以防止orexin-A被体内的酶所降解，从而提高其稳定性，延长其体内半衰期，具有较好的发挥orexin-A生物活性的能力。3、本专利技术所提供的orexin-A脂质体鼻喷剂(或注射剂)可明显提高大鼠觉醒时间，从而提高治疗发作性睡眠的疗效。此外，由于orexin-A是正常存在于人体中的一种神经多肽，因此就开发成药品的角度而言，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势，研制开发orexin-A类药物用于治疗发作性睡眠具有广泛的应用前景。说明书附1为传统工艺与改良工艺脂质体包封率比较。图2为orexin-A脂质体、orexin-A与空白组12h活动时间比较。图3为orexin-A给药前与给药后12h活动时间比较图4为orexin-A不同剂量组Mh总体活动时间。图5为orexin-A与莫达非尼给药前后1 活动时间。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1一种orexin-A载药脂质体的制备方法，包括下述步骤a、准确称量orexin-A，用pH = 7. 2-7. 6的PBS (磷酸盐缓冲液)配制成质量浓度为20 μ g/mlorexin-A原液；其中orexin-A多肽采用商售的产品(美国Tocris公司， No. 1455)；b、称取卵磷脂400mg，胆固醇160mg，膜材PEG2000-DSPE (长循环脂质体)96mg,溶解于IOOml三氯甲烷中得到混合液；C、将上述混合液于30°C水浴减压旋转蒸发；d、蒸干后滴加PBS溶液10ml，制得水性混悬液；e、探头式超声仪超声3min，冷至室温；f、将orexin-A原液5ml加入水性混悬液中超声Imin后，再加入orexin-A原液 5ml,室温下磁力搅拌30min，0. 45 μ m滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体，终浓度 10μ g/ml。所得载药脂质体平均粒径5 士 5. 6nm，包封率也从原来的72%提高到98% (图 1)。对所得脂质体微囊和包裹于其中的神经多肽食欲素-A，可应用制备治疗发作性睡眠的凝胶剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、粉针剂。例如对实施例1所制备的orexin-A载药脂质体进行冷冻干燥即得鼻喷剂。或将该orexin-A载药脂质体的鼻喷剂溶于生理盐水中，可用于腹腔及静脉注射。实施例2另一种orexi本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种ｏｒｅｘｉｎ－Ａ载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤ａ．将ｏｒｅｘｉｎ－Ａ多肽准确称量，用ｐＨ为７．２－７．６的磷酸盐缓冲液ＰＢＳ，配制成２０μｇ／ｍｌ的ｏｒｅｘｉｎ－Ａ原液；ｂ．称取４００ｍｇ卵磷脂、１６０ｍｇ胆固醇、９６ｍｇ的膜材ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ，溶解于１００ｍｌ三氯甲烷中得到混合液；ｃ．将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；ｄ．蒸干物中滴加１０ｍｌ磷酸盐缓冲液ＰＢＳ，制得水性混悬液；ｅ．用对水性混悬液超声３～５ｍｉｎ，冷至室温；ｆ．将１０ｍｌ的步骤ａ所得ｏｒｅｘｉｎ－Ａ原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌３０ｍｉｎ，０．４５μｍ滤膜过滤２次，即得ｏｒｅｘｉｎ－Ａ载药脂质体。
【技术特征摘要】
1.一种orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤a.将orexin-A多肽准确称量，用pH为7.2-7. 6的磷酸盐缓冲液PBS，配制成20 μ g/ml 的orexin-A原液；b.称取400mg卵磷脂、160mg胆固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于IOOml三氯甲烷中得到混合液；c.将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发；d.蒸干物中滴加IOml磷酸盐缓冲液PBS，制得水性混悬液；e.用对水性混悬液超声3 5min，冷至室温；f.将IOml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌 30min, 0. 45 μ m滤膜过滤2次，即得orexin-A载药脂质体。2.根据权利要求1所述的orexin-A载药脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a 中的orexin-A多肽的制备方法包括下述步骤；(1)将Ig的Rink-MBHAresin树脂用IOml的DMF溶液溶胀40分钟；(2)将溶胀后的上述Rink-MBHAresin树脂用DMF溶液洗涤三次...
【专利技术属性】
技术研发人员：董海龙，熊利泽，仝黎，张昊鹏，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87
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