H5N1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途技术

本申请涉及H5N1亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途。具体而言，本申请涉及含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的禽流感假病毒、其制备方法及其用途；以及用于制备该假病毒的系统。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及H5m亚型禽流感假病毒的制备方法及其用途。
技术介绍
禽流感(avian influenza, Al)是由A型流感病毒引起的一种家禽和野禽感染的疾病综合征。其病原禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)属正粘病毒科，流感病毒属，为单股负链RNA病毒。对A型流感病毒，根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶 (NA)抗原性的不同，又将流感病毒进一步分为不同的亚型。目前，A型病毒有16种HA亚型 (H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)，这些亚型均在禽流感病毒中存在。禽流感病毒依据病毒毒性又分为两类高致病性禽流感病毒(HPAI)，它可以导致全身性的致死感染，最快在感染后M小时内杀死鸟类，通常在一周内致死；低致病性禽流感病毒(LPAI)，它很少会引起严重疾病的爆发，相关的患病率和致死率也比HPAI低。在1997年5月，一株H5W AIV在香港一名三岁男孩中分离得到，男孩最终死于由 REYE综合症引起的严重流感肺炎，这表明携带HPAI H5N1病毒的鸟类可以直接将病毒传向人类。与HPAI H5N1相关的最严重一次爆发出现在2003-2004年亚洲的10个国家，导致大约1. 5亿只禽类死亡。尽管HPAI病毒的爆发在大多数国家中主要限制在家禽中(主要是鸡类)，但是存在潜在的可能传向人类，越南，泰国和柬埔寨三个国家共计发生53例感染HPAI 病毒死亡案，且这次爆发的致死率远远高于1997年那次(54. 6%对33.3%，据官方报道的病患数字)。禽流感的爆发引起了世界范围内对高致病性禽流感病毒在无免疫力人群中大规模传染的担忧，迫切需要人们对高致病性禽流感病毒进行系统研究。假病毒(pseudo type virus)是指一种病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的包膜，而基因组保持着病毒本身基因组特性的病毒W]。假病毒技术的应用主要是基于两点即一种有囊膜的病毒其感染细胞仅仅是由其包膜蛋白所决定的，其次，一种病毒的包膜能够整合到另外一种病毒颗粒的表面。假病毒感染系统易于操作，它在细胞内只能进行单一周期复制，安全性好；其在体外环境下模拟天然病毒感染细胞的过程，具有广泛的宿主范围，更高的转染效率，还具有抵抗血清补体的攻击，非细胞周期依赖性地高效转染静止细胞等优点，因而假病毒在研究病毒进入过程、受体鉴定、中和抗体检测、疫苗评价等方面具有重要作用。在国外，已对一些危险病毒构建了一系列以反转录病毒为载体的假病毒体系，如人免疫缺陷病毒，丙型肝炎病毒，埃博拉病毒，SARS冠状病毒等。目前存在若干种假病毒制备系统，常见的如在鼠白血病病毒(MuLV)基础上构建的假病毒系统。对于MuLV系统来说，主要由3个质粒组成，分别为MuLV基因组质粒(包括包装信号、标记基因LacZ)、MuLV结构蛋白表达质粒(gag，pol)和外源囊膜表达质粒。当将三种质粒共转染HEK293T(人胚肾293T)细胞时，上清当中就会产生病毒样颗粒，这些复制缺陷型病毒颗粒可以感染许多种细胞类型。本专利技术将采用一种新的假病毒系统制备方法， 并探讨这种方法的安全性和有效性。禽流感病毒表面抗原血凝毒(HA)和神经氨酸酶(NA)与病毒的致病性、复制及传播关系密切。HA表面抗原介导了病毒与宿主细胞表面受体的结合并促进了病毒融合过程中病毒RNA的释放。HA分子的前体在翻译后被宿主细胞内的蛋白酶切割成HAl和HA2亚基， 在HA2的氨基末端产生了一个融合遗传区域，介导了病毒与细胞质膜的融合。因此，HA表面抗原在病毒的致病性方面起着重要角色，是病毒感染细胞的先决条件。NA是禽流感病毒表面的另一种重要抗原，它通过水解宿主细胞表面特异性受体糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸，促进成熟的病毒从宿主细胞中释放从而进一步感染其它宿主细胞。已知H5m亚型高致病性禽流感病毒具有高度传染性，且病死率较高，直接用H5m 亚型高致病性禽流感病毒开展研究具有相当大的危险性，且需要苛刻的实验条件，因此研制H5m亚型高致病性禽流感病毒的假病毒感染模型非常必要和急需。
技术实现思路
本专利技术的假病毒以HIV病毒包装质粒pNL4-3Luc+Env-Vpr-为假病毒包装质粒，该质粒可以表达荧光素酶作为报告基因，Vpr为复制酶蛋白基因，其缺陷导致病毒无法复制， Env编码病毒的包膜糖蛋白，其缺陷使得该质粒无法表达膜蛋白，Env及Vpr基因的同时缺失，使该质粒不具有感染能力以及进一步复制产生新一轮的病毒的能力，保证生物安全性。 本专利技术通过聚合酶链反应(PCR)方法，将H5W禽流感病毒的HA和NA全长基因连入一个真核细胞表达载体pBudCE4. 1，相比将两个基因连入不同的载体，这保证了基因表达效率的一致性，将该质粒作为外源目标膜蛋白基因与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装出子代禽流感假病毒颗粒。该假病毒颗粒具有感染禽流感病毒易感细胞系(如MDCK)的功能。通过假检测病毒感染细胞后所表达的荧光素酶，就可以定量地反映假病毒对细胞的感染情况并进而判断假病毒的有效性。由此完成本专利技术。因此，本申请提供一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因。在一个具体实施例中，所述包装质粒表达报告基因。在一个具体实施例中，所述报告基因编码荧光素酶。在一个具体实施例中，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+Env_Vpr_ ；pHR，CMV-Luc和 pCMVR Δ 8. 2。在一个具体实施例中，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、Η5亚型和Η7亚型的HA基因和NA基因。在一个具体实施例中，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCC NO :V200917的禽流感假病毒。本申请还提供一种制备禽流感假病毒的方法，该方法包括使用含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒和包装质粒共转染宿主细胞，培育该宿主细胞，和从培养基上清中收集禽流感假病毒。在一个具体实施例中，所述包装质粒选自pNL4-3Luc+EmTVpf ；pHR’ CMV-Luc和 pCMVR Δ 8. 2。在一个具体实施例中，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、H5亚型和H7亚型的HA基因和NA基因。在一个具体实施方式中，所述宿主细胞选自HEK293T细胞和细胞。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因含于相同的一个质粒中。在一个具体实施例中，使用真核细胞表达载体来构建同时含有HA基因和NA基因的质粒。在一个具体实施方式中，所述真核细胞表达载体选自pBudCE4. 1、pcDNA3. 1和 pCMV/R。本申请还提供禽流感假病毒的用途，用于测定感染者体内的中和抗体的效价或寻找禽流感病毒表面中和抗体结合的表位，或者用于体外药物筛选或疫苗效果评价。在一个具体实施方式中，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCC NO :V200917的禽流感假病毒。本申请还提供一种禽流感假病毒制备系统，该系统包括包装质粒和含有高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因的质粒。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因分别处于独立的质粒中。在一个具体实施方式中，所述HA基因和NA基因处于同一质粒中。在一个具体实施方式中，所述HA基因和N本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的ＨＡ基因和ＮＡ基因。

【技术特征摘要】
1.一种禽流感假病毒，该病毒含有包装质粒和高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因。2.如权利要求1所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述包装质粒表达荧光素酶作为报告基因。3.如权利要求1或2所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述包装质粒选自 pNL4-3Luc+EnvTpr ；pHR' CMV-Luc 和 pCMVRA8. 2。4.如权利要求1-3中任一项所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述高致病力禽流感病毒的HA基因和NA基因选自禽流感病毒Hl亚型、H5亚型和H7亚型的HA基因和NA基因。5.如权利要求1-4中任一项所述的禽流感假病毒，其特征在于，所述禽流感假病毒为保藏编号为CCTCC NO :V200917的禽流感假病毒。6.一种制备禽流感假病毒的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兵，徐莹，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31