一种牛初乳提取物及其提取方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种牛初乳提取物及其提取方法和应用，该提取物含有序列为SEQ?ID?NO.1的Mir-30a-5p微囊泡，可通过如下方法获得：将牛初乳以5000×g离心30分钟后取中层液，再依次以12000×g、35000×g、70000×g、110000×g离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的110000×g离心中层液即为所述的牛初乳提取物。实验证实本发明专利技术牛初乳提取物含有丰富的Mir-30a-5p，用它处理经顺铂化疗后的癌细胞，可有效抑制其依靠吞噬自身而继续生存，加速死亡，可增进化疗药物的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牛初乳提取物及其提取方法和应用，具体涉及一种富含 Mir-30a-5p微囊泡的牛初乳提取物及其提取方法和应用。
技术介绍
癌症是危害人类健康和生命的头号杀手。近年来，全球新增癌症病例逐年上升，目前达到1200万例，中国内地每年新增癌症患者近200万，死亡约150万，目前发病率以每年 2. 5%的速度增加。尽管人类经过了无数的努力试图攻克癌症这一顽症，但即使在发达的国家，癌症的治愈率也仅为45% 50%，发展中的国家癌症治愈率更低。相当多的癌症晚期患者处在无休止地手术、放疗、化疗中，不但增加了患者们痛苦，还使患者家属劳民伤财，使他们背负了沉重的社会负担。目前治疗癌症的方法主要是手术摘除、放射治疗和化学治疗三种方式。但手术治疗难免破坏正常组织，威胁生命或造成畸型或功能丧失。放射治疗对扩散或侵润广泛的癌症达不到治疗效果，而且放射治疗时高剂量射线在杀灭癌细胞的同时也损伤了正常细胞。 化疗药物毒副作用较大，造成患者恶心、呕吐、脱发、白细胞减少、不育等。化疗本身也是诱发肿瘤的一个因素。临床实践证明，大剂量放、化疗只能导致虚弱的生命更加垂危，加速患者死亡。顺钼(DDP)是癌症化疗药物中的一种，具有抗瘤谱广、作用强、无交叉耐药，可与其他药物联合，广泛用于多种癌症的治疗，而且价格便宜。它是一种无机钼的金属络合物， 含一个二价钼及两个氨分子和两个氯原子，类似于双功能烷化剂，可与DNA形成链内和链间交叉联结，破坏DNA功能，阻止DNA复制，为细胞周期非特异性药物。肿瘤对化疗和放疗的耐受机制与癌细胞在不利环境下自吞噬有关。癌细胞在抗癌药物和放射刺激下，可通过吞噬自身的一部分机体作为营养度过暂时的不利环境以求得继续生存。一旦停止用药或化疗，这些癌细胞又可恢复恶性增生能力，导致病症复发。癌细胞的自吞噬生存机制对放疗和化疗效果不利。抑制癌细胞自吞噬，促进其凋亡，是提高药物疗效，增进患者康复的重要课题。癌细胞自吞噬受Beclin 1基因调节，beclin 1表达增高可促进细胞自吞噬。 Beclin 1基因受到抑制，则会引起细胞自吞噬水平降低，从而抑制癌细胞和肿瘤以自噬的方式继续存活，促进肿瘤组织消亡或癌细胞凋亡，增进患者康复。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种牛初乳提取物。本专利技术的另一目的是提供从牛奶中提取分离该牛初乳提取物的方法。本专利技术的又一目的是提供该牛初乳提取物的应用。 一种牛初乳提取物，该提取物含有序列为SEQ ID NO. 1 (UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)3的Mir-30a-5p微囊泡。其中，所述的牛初乳提取物通过如下方法获得将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000 X g,35000 X g、70000 X g、110000 X g离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳为乳牛分娩后最初3日内所挤的乳汁。一种提取所述的牛初乳提取物的方法将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000Xg,35000Xg、70000XgU 10000Xg离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。所述的牛初乳为乳牛分娩后最初3日内所挤的乳汁。所述的牛初乳提取物在制备治疗各种癌症的药物中的应用。所述的癌症为乳腺癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肺癌、肝癌、肾癌、食道癌、卵巢癌、 直肠癌、结肠癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨癌、鼻咽癌或脑瘤等。有益效果专利技术人首次发现牛初乳中含有丰富的Mir-3a-5p，是牛成乳中的6 8倍。并从牛初乳中分离到富含Mir-30a-5p微囊泡的提取物。使用该牛初乳提取物处理顺钼化疗后的癌细胞，可增加癌细胞中的Mir-30a-5p，而细胞自源性I^re Mir-30a变化不大，吞噬相关基因Beclin-I表达降低，抑制癌细胞依赖自吞噬而继续生存，自噬泡减少，自噬泡相关蛋白 LC3-II降低，促进癌细胞凋亡。本专利技术所需的牛初乳获得容易，所需设备简易，仅需高速离心机和超速离心机，方法简单实用，效果显著。附图说明图1. Solexa分析牛初乳和牛成乳中micro RNA的含量。括号圈住的为mir-30a_5p。图2. Q-PCR验证牛初乳和成乳中mir-30a_5p的含量。图3.牛初乳各离心组分中的Mir-30a-5p含量比较。comp为未做组分分离的牛初乳，5kg代表离心力5000 X g，12kg代表离心力 12000 X g, 35kg代表离心力35000 X g, 70kg代表离心力70000 X g, 1 IOkg代表离心力 IlOOOOXg, up代表上层，mid代表中层，sed代表沉淀。图4.从牛初乳IlOOOOXg离心中层液中分离到的微囊泡，A 扫描电镜图；B 透射电镜图。图5.用牛乳IlOOOOXg离心中层液转染Hela细胞后癌细胞中的Mir-30a-5p含量比较。图6.用牛乳110000 Xg离心中层液转染Hela细胞后癌细胞中的pre Mir-30a_5p含量比较。图7.牛乳IlOOOOXg离心中层液处理后的Hela癌细胞中Beclin-I水平比较。图8.牛乳IlOOOOXg离心中层液抑制顺钼化疗过的Hela癌细胞自吞噬形成自噬泡数量比较。A 顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkXg离心组分后自吞噬泡数量的影响；B:顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkX g离心组分后自吞噬泡数量的变化；图9.牛乳IlOOOOXg离心中层液处理顺钼化疗过的Hela癌细胞，自噬体标志蛋白LC3-II/LC3-I的比例比较。A 顺钼化疗后的Hela癌细胞在加入牛乳IlOkX g离心组分后LC3-II/LC3-I的变化；B 顺钼化疗后的Hela癌细胞在加入牛乳IlOkX g离心组分后LC3-II/LC3-I比值的变化。图10.牛乳IlOOOOXg离心中层液促进Hela癌细胞凋亡效果比较。A 牛乳IlOkXg离心中层液对顺钼化疗后的Hela癌细胞凋亡率的影响；B 顺钼化疗后的Hela癌细胞加入牛乳IlOkX g离心中层液后凋亡率的变化。上述图5 10 中 FBS 胎牛血清；DDP 顺钼；Anti 含 mir-30a_5p inhibitor 的脂质体；MMV 牛成乳110000Xg离心所得中层液；CMV 牛初乳110000Xg离心所得中层液。具体实施例方式实施例1. Solexa测量牛初乳与牛成乳中的micro RNA取Iml牛初乳与牛成乳分别加入15ml离心管，分别加入3ml苯酚混勻后各加 Iml氯仿混勻，以12000Xg离心lOmin，取上清液，各加Iml异丙醇混勻后，放在_20°C沉淀lh，再以12000Xg离心lOmin，弃上清，往沉淀中加入75%乙醇-DEPC水1ml，混勻后以 12000 Xg离心lOmin，弃上清，敞口置室温直至管内液体挥发干净，加入20 μ 1 DEPC水溶解，各取适量牛初乳和牛成乳提取总RNA作Solexa测试和Q-PCR，测试其中所含的micro RNA及相应含量。利用Oli本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种牛初乳提取物，其特征在于该提取物含有序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１的Ｍｉｒ－３０ａ－５ｐ微囊泡。

【技术特征摘要】
1.一种牛初乳提取物，其特征在于该提取物含有序列为SEQ ID NO. 1的Mir-30a-5p微囊泡。2.根据权利要求1所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳为母牛产犊后最初 3天内的乳汁。3.根据权利要求2所述的牛初乳提取物，其特征在于所述的牛初乳提取物通过如下方法获得将牛初乳以5000Xg离心30分钟后取中层液，再依次以12000Xg、35000Xg、 70000Xg、110000Xg的离心力，取上一次离心所得的中层液作为下一次离心的原液各离心 1小时，最后得到的IlOOOOXg离心中层液即为所述的牛初乳提取物。4.一种提取权利要求1所述的牛初乳提取物的方法，其特征在于将牛初乳以5000X...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾科，邹珍友，吴临平，张骑鹏，张辰宇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84