本发明专利技术属于微生物工程技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁Odontotermesformosanus(Shiraki)内生放线菌的发酵液中提取到的新大环内酯(deminamicin)及其制法和应用。deminamicin对幽门螺旋杆菌有很强的抑制作用，因此deminamicin可作为抗幽门螺旋杆菌的化合物，并在制备新型抗生素药物中得到应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程
，具体涉及从黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)内生放线菌的发酵液中提取到的新大环内酯(deminamicin) 及其制备方法与应用。
技术介绍
放线菌能产生多种生物活性物质，它为抗生素工业的建立和发展发挥过巨大作用。经过多年的研究，从放线菌中分离得到的先导化合物数量锐减，发现新抗生素的几率也大大降低。来源于特殊生境的放线菌引起了一些研究者的兴趣，研究特境放线菌的次生代谢产物成为筛选新型抗生素的一条重要途径。昆虫是地球上一类分布广泛、种类和数量巨多的生物资源，昆虫肠道内生存着无数微生物，昆虫种类、数量及分布的多样性造就了昆虫肠道内生菌的多样性。昆虫肠道放线菌是一类特境放线菌，人们对其次生代谢产物的研究较少。白蚁以各种树木为食，它们能消化难以分解的树木纤维，白蚁肠道内的微生物在白蚁消化树木纤维的过程中发挥着很大作用。然而，到目前为止，尚未见对白蚁内生放线菌次生代谢产物的研究报道。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是：1. 提供一种白蚁内生放线菌；2. 具有抗菌活性的新大环内酯(deminamicin)；3. 提供一种提取、分离deminamicin的方法；4. 提供新大环内酯(deminamicin)在开发抗生素药物中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。deminamicin的结构为：-->deminamicindeminamicin的制备方法，它包括下述步骤：步骤1. 将新鲜的从黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)肠道中分离、纯化得到的放线菌（BY-4）菌体块接种到在高氏1号培养基（可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，1 L 蒸馏水）上，在140 rpm、28℃条件的摇床上培养5天作为种子液；步骤2. 将种子液接种于高氏1号培养基中，在140 rpm、28℃条件下发酵14天；步骤3. 将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取4次，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1；步骤4. 将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2；步骤5. 对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿、氯仿：甲醇=100:1、氯仿:甲醇=100:2、氯仿:甲醇=100:4、氯仿:甲醇=100:8、氯仿:甲醇=100:16和甲醇进行洗脱，浓缩100:4（氯仿:甲醇）段得到黑色浸膏F3；步骤6. 然后对浸膏F3进行Sephadex LH-20分离（洗脱液为甲醇），共得11瓶，将7-9瓶合并得浸膏F4；步骤7. 对浸膏F4，用反相硅胶柱进行分离，先用20%甲醇（酒精计测量）进行洗脱除去大极性杂质，然后用45%甲醇洗脱，真空浓缩洗脱液得褐色固体F5；步骤8. 用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS-2.5 mm (250R4.6 mm) column）在流动相为51%甲醇（酒精计测量）、波长为210 nm、流速为2.0 mL/min的条件下对浸膏F5进行分离，共出现6个主要成分，保留时间为32.9 min的第4成分为deminamicin。本专利技术的新大环内酯deminamicin对厌氧菌具有较强的抑制作用，特别是对幽门螺旋杆菌标准菌有很强的抑制作用，deminamicin可作为一种新颖的抗生素，制备新抗生素药物。与现有技术相比，本专利技术具有下述突出优点：1. 本专利技术的deminamicin是结构新颖的化合物，可以作为抗生素或先导化合物，制备成新型抗生素药物；2. 本专利技术的deminamicin可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。具体实施方式通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本专利技术。但它们不是对本专利技术的限定。实施例1：白蚁内生放线菌BY-4的分离与纯化本专利技术所用的放线菌是于2005年9月从南京市紫金山南麓捕捉的黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)的肠道内分离得到的一株内生放线菌，菌株编号为BY-4，现保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：武汉珞珈山武汉大学内），保藏编号为CCTCC M 2010366，保藏日期为2010年12月27日。在无菌条件下将白蚁在70%酒精中表面消毒2分钟，剪去头部，取用腹部，用无-->菌水漂洗腹部3次，加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，分别取各梯度稀释液0.2毫升涂布于高氏1号培养基中，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取孢子纯化培养，得到白蚁肠道内生放线菌。实施例2：白蚁内生放线菌BY-4的液体发酵活化白蚁内生放线菌BY-4，将新鲜的菌体块接种到1000 mL 锥形瓶中，每瓶含有400 mL的高氏1号培养基，接种5－6瓶于摇床上，在140 rpm、28 ℃条件下培养5天作为种子液，然后将20 mL种子液接种于含有400 mL的高氏1号培养基的1000 mL 锥形瓶中，在140 rpm、28℃条件下发酵14天。实施例3：deminamicin的提取与分离实施例2中所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1。将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2，对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿、氯仿：甲醇=100:1、氯仿:甲醇=100:2、氯仿:甲醇=100:4、氯仿:甲醇=100:8、氯仿:甲醇=100:16、甲醇进行洗脱，浓缩100:4（氯仿:甲醇）段得到黑色浸膏F3，然后对浸膏F3进行Sephadex LH-20分离（洗脱液为纯甲醇），共得11瓶，将7-9瓶合并得浸膏F4，对浸膏F4用反相硅胶柱进行分离，先用20%甲醇（酒精计测量）进行洗脱除去大极性杂质，然后用45%甲醇洗脱，真空浓缩洗脱液得褐色固体F5，用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS-2.5 mm (250R4.6 mm) column）在流动相51%甲醇（酒精计测量）、波长为210 nm、流速为2.0 mL/min的条件下对浸膏F5进行分离，共出现6个主要成分，保留时间为32.9 min的第4成分为deminamicin。实施例4：deminamicin的结构鉴定deminamicin的结构是根据它们的质谱、核磁共振谱（包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、COSY、HMBC、NOE）而确定的。deminamicin一些光谱学数据如下：deminamicin，无色晶体，易溶于丙酮和甲醇，在254和365nm紫外下无荧光吸收，1H 和 13C NMR数据见表1；HRESIMS: m/z 447.1992 [M+Na]+, calculated for C22H32NaO8, 447.1986。表1. deminamicin的1H (300 MHz) 和13C-NMR (75 MHz) 数据 (CD3COCD3)PositionδCδH(JinH本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种白蚁内生放线菌，菌株编号为ＢＹ－４，其特征是在高氏一号平板上，基内菌丝灰褐色，气生菌丝白色，孢子灰褐色，菌落产生花状边缘；在查氏培养基上状态较特殊，基内菌丝浅黄色，气生菌丝亮黄绿色，孢子褐色；经鉴定为链霉菌属Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．，现保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉珞珈山武汉大学内，保藏编号为ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１０３６６，保藏日期为２０１０年１２月２７日；从其高氏液体发酵提取物中可以分离纯化获得具有抗菌活性的新大环内酯ｄｅｍｉｎａｍｉｃｉｎ。
【技术特征摘要】
1.一种白蚁内生放线菌，菌株编号为BY-4，其特征是在高氏一号平板上，基内菌丝灰褐色，气生菌丝白色，孢子灰褐色，菌落产生花状边缘；在查氏培养基上状态较特殊，基内菌丝浅黄色，气生菌丝亮黄绿色，孢子褐色；经鉴定为链霉菌属Streptomyces sp.，现保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉珞珈山武汉大学内，保藏编号为CCTCC M 2010366，保藏日期为2010年12月27日；从其高氏液体发酵提取物中可以分离纯化获得具有抗菌活性的新大环内酯deminamicin。2.一种权利要求1所述白蚁内生放线菌制备的大环内酯的结构为： 。3.一种权利要求2所述的大环内酯deminamicin的制备方法，其特征是由以下步骤构成：步骤1. 将新鲜的从黑翅土白蚁Odontotermes formosanus肠道中分离、纯化得到的放线菌BY-4菌体块接种到在高氏1号培养基，培养基组成为：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，1 L 蒸馏水，于摇床上，在140 rpm、28 ℃条件下培养5天作为种子液；步骤2. 然后将种子液接种于高氏1号培养基中，在140 rpm、...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭仁祥，毕淑峰，梅亚宁，宋勇春，郭也，李方，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84
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