本发明专利技术公开一种突变的黄粉虫抗菌肽及其制备获得方法及其应用。所述的突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ?ID?NO.1所示的碱基序列，全长为195bp，其编码由序列表中序列表SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组突变黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。本发明专利技术获得重组突变的黄粉虫抗菌肽具有很强的热稳定性，在沸水中煮沸8h，抑菌活性不变，耐酸、碱特性，pH在2-12的范围内，抗菌活力保持不变，广谱抗菌的功能突出，对微生物具有显著的抑制作用，尤其是对耐药菌具有显著的抑制作用，具有广泛的应用领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物次生物质代谢
具体的说，本专利技术涉及一种高效表达重组突变的黄粉虫抗菌肽及其高效表达的应用。
技术介绍
抗菌肽广泛存在于各种有机体内，包括细菌、昆虫、植物和脊椎动物，已经从多种生物体内分离得到抗菌肽，它们具有广谱抗菌活性，可以保护机体抵御细菌、病毒、真菌和一些寄生物的侵染，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。目前越来越多的细菌对传统抗生素产生了耐药性，尤其是超级细菌的出现，新型抗生素的研发速度相对较慢，对付超级细菌已经成为现代医学面临的一个难题。与传统抗生素作用机理不同，抗菌肽通过破坏质膜结构达到抑杀细菌的作用，是目前抗病原微生物药物开发研究中的热点，有望成为新一代的抗菌制剂。近年来，对昆虫抗菌肽的研究已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。黄粉虫(Tenebrio molitor)其幼虫别名面包虫，既是一种生理、遗传学实验材料，又为极具开发潜力的重要资源昆虫。虽然黄粉虫在我国分布广，资源丰富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005%)，成本高未能实现工业化生产。随着现代生物技术的发展，获得黄粉虫抗菌肽基因的高效表达，为黄粉虫抗菌肽的研究和开发具有重要的眉、ο
技术实现思路
针对现有技术天然抗菌肽含量少，提取得率低，重组抗菌肽的表达量不高的现状， 本专利技术旨在提供一种高表达的突变黄粉虫抗菌肽的基因序列和编码多肽序列，以应用于黄粉虫抗菌肽的大量制备中。本专利技术的技术方案根据GenBank中的黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1设计特异性引物，从黄粉虫的3龄幼虫中克隆到黄粉虫抗菌肽的tenecin 1 cDNA分子，所编码的蛋白质富含半胱氨酸；扩增获得tenecin 1 cDNA分子的开放阅读框是25^p，为了获得黄粉虫抗菌肽的原核高效表达，本专利技术设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分核酸序列， 同时获得带有更多正电荷的抗菌肽，以利其高抗菌活性的发挥，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得本专利技术用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名为TmAMPlm。将突变的黄粉虫抗菌肽基因TmAMPlm 195bp亚克隆至原核表达载体，转化大肠杆菌，获得了突变的黄粉虫抗菌肽基因的高效表达，抑菌实验证明所表达的黄粉虫抗菌肽具有明显的抑菌活性，为黄粉虫抗菌肽的大量制备奠定了基础。具体的，本专利技术提供了一种突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的碱基序列，全长为l^bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中65 个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。同时，本专利技术提供了一种重组突变的黄粉虫抗菌肽的获得方法，具体包括如下步骤1.黄粉虫总RNA的提取和反转录合成cDNA。取大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA ；A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV (RNase H-)，反转录合成eDNA。2. PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)。以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和)(h01 位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1 ；在1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR结果，回收PCR产物，连接T载体；进行测序分析，鉴定获得了正确的tenecin 1。3.突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增。设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分基因，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得本专利技术用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名为TmAMPlm。获得突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的流程图见图1。4.原核表达载体的构建及表达。将回收的PCR产物TmAMPlm基因与表达载体pET30a分别进行双酶切，对双酶切的TmAMPlm，pET30a进行过夜连接，获得pET30a_TmAMPlm重组质粒。pET30a_TmAMPlm转化感受态细胞E. coli DH5 α，筛选阳性克隆，阳性克隆大量培养并提取质粒。将提取的质粒 pET30a-TmAMPlm转化感受态细胞Ε. coli BL21，卡那霉素筛选获得阳性克隆。将含重组质粒的阳性克隆在37°C培养，加入IPTG诱导获得可溶性、突变的黄粉虫抗菌肽。进一步，本专利技术提供了一种突变的黄粉虫抗菌肽详细的获得方法，具体包括如下步骤1.黄粉虫总RNA的提取操作前实验台用紫外灯照射30min后，取一条大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA 酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有ImLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡 15s，15 30°C室温放置3 5min，4°C、12000r/min离心15min，小心的将上清移入干净 Eppendorf管中，加入氯仿0. 22mL抽提蛋白质，震荡15s，15 30°C室温放置3 5min， 4°C、12000rpm离心lOmin，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1. 5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0. 5mL, 15 30°C室温放置10min，4°C、 12000rpm离心lOmin。弃上清，沉淀部分加入75%乙醇溶液(无RNA酶水配置)lmL，洗涤， 4°C,7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混勻，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余_70°C保存。2.反转录合成cDNAEP管中配制下列模板RNA/引物混合液10 μ L总RNA，10 μ L OligodT-Adaptor引物，31. 5 μ L无RNase的水，70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。离心数秒使模板 RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51. 5 μ L上述RNA/引物变性溶液，20 μ L5 XM-MLV 缓冲液，20 μ L dNTP, 2. 5 μ L RNase 抑制剂，6 μ L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C保温 lh, 70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。3. PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)以上述合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和B10I 位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1。上游引物Fl CGCGGATCCATGAAGCTTACAATCTTCGC下游引物Rl CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR 反应体系13. 9μ L dd H2O, 2 μ L 10 X Taq 缓冲液，1· 6 μ L dNTPs, 0. 6 μ LMg2+, 0. 4μ L Primer (Fl) ,0. 4μ L Primer (F2), 1 μ L cDNA。PCR反应条件95°C预变性 lmin，95°C 变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循环。最后72°C温育IOmin04. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种突变的黄粉虫抗菌肽，其特征在于，所述的一种突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的碱基序列，全长为１９５ｂｐ，其编码由序列表中序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示的氨基酸序列中６５个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种突变的黄粉虫抗菌肽，其特征在于，所述的一种突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的碱基序列，全长为l%bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列中65个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽属于富含半胱氨酸类抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。2.一种如权利要求1所述的突变的黄粉虫抗菌肽的获得方法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)黄粉虫总RNA的提取和反转录合成cDNA 取大约3龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA ；A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV (RNase H-)，反转录合成 eDNA ；PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因(tenecin 1)以步骤1合成的cDNA为模板，设计上、下游引物，引入限制性内切酶BamHI和BioI位点，PCR扩增黄粉虫抗菌肽基因tenecin 1 ；在 1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR结果，回收PCR产物，连接T载体；进行测序分析，鉴定获得了正确的tenecin 1 ；(3)突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分基因，将成熟肽部分N端的两个谷氨酸突变成两个精氨酸；从而获得用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠渊，张富春，唐馨，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：65
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