糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种糜蛋白酶的新用途，具体是糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用。由于糜蛋白酶可直接降解有机杀虫剂，且通过基因工程可大量生产，这就为大规模应用于清除农产品表面的残留杀虫剂、治理被杀虫剂污染的土壤和废水、对杀虫剂中毒后人、畜的解毒提供新的途径。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种糜蛋白酶的新用途，具体是糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用。
技术介绍
使用有机杀虫剂(农药)是消灭农业和卫生害虫，保障农作物增产、稳产及人类健康的经济有效的手段。目前使用的有机杀虫剂以有机磷和菊酯类为主。长期以来，由于过多过滥地使用杀虫剂，致使农产品、土壤和水源中的杀虫剂大量残留，污染日趋严重。寻求有效的方法降解杀虫剂，减少对环境及人体健康的危害是目前迫切需要解决的问题。生物处理战略对根除和减少杀虫剂残留具有较大的潜力。例如，可将污染的农产品、水源和土壤通过含酶的生物发生器，降解杀虫剂，从而减少其残留水平和时间。糜蛋白酶属丝氨酸蛋白酶家族，生理学功能包括摄食蛋白的消化、血液凝固、免疫反应、信号传导、激素活化和发育，其在昆虫幼虫中肠大量表达，参与摄食蛋白的消化。有研究显示，鳞翅类昆虫中肠丝氨酸蛋白酶可降解其体内病原体苏云金杆菌的伴孢晶体蛋白，从而抵抗苏云金杆菌对昆虫的杀伤力。申请人在先前的中国专利申请(申请号为02112820.0)的说明书第1页，提到“糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色库蚊中高表达，因此推测淡色库蚊糜蛋白酶基因可能与淡色库蚊抗溴氰菊酯抗药性有关。”但是，该申请仅根据糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色库蚊中高表达的特点，不能充分表明该基因(淡色库蚊糜蛋白酶)与淡色库蚊抗溴氰菊酯抗药性有关，有待进一步的深入研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种糜蛋白酶的新用途。本专利技术的技术方案是糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用。上述技术方案中所说的有机杀虫剂可以是但不限于有机磷类、菊酯类杀虫剂。上述技术方案中所说的有机磷类杀虫剂可以是但不限于马拉硫磷、二嗪农杀虫剂，菊酯类杀虫剂可以是但不限于溴氰菊酯、高效氯氰菊酯杀虫剂。上述技术方案中所说的糜蛋白酶优选但不限于淡色库蚊糜蛋白酶、牛源性糜蛋白酶。专利技术人应用基因重组及蛋白表达技术，将在杀虫剂抗性蚊虫中高表达的糜蛋白酶基因片段克隆到pET-32a(+)质粒中，构建pET-32a(+)/NYD-Ch重组质粒，转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并诱导表达；表达产物经镍金属螯合亲和层析后获得重组蛋白，复性为活性蛋白；将糜蛋白酶活性蛋白与溴氰菊酯共同对蚊四龄幼虫进行生物测定，结果蚊敏感和抗性品系的LC50分别提高0.022和2.8ug/ml，表明表达的糜蛋白酶能使溴氰菊酯降解。用NYD-Ch表达蛋白作用溴氰菊酯后进行气相色谱分析显示，随着NYD-Ch浓度的增加，溴氰菊酯含量逐渐下降，表明糜蛋白酶对溴氰菊酯有直接降解作用；质谱分析进一步显示，NYD-Ch可将溴氰菊酯分解为对哺乳动物无毒的二溴乙烯二甲基环丙烷羧酸(Br2CA)和苯氧基安息香酸(3-PBA)。在24小时内，10mg NYD-Ch表达蛋白可降解4.03ug溴氰菊酯，降解率达80.6％。上述的糜蛋白酶对高效氯氰菊酯、马拉硫磷、二嗪农杀虫剂也表现出降解作用。牛源性糜蛋白酶与NYD-Ch同属于丝氨酸蛋白酶超家族成员，氨基酸比对显示出比较高的同源性。进一步用牛源性糜蛋白酶进行对杀虫剂降解测定，亦获得相似结果。由于糜蛋白酶可直接降解有机杀虫剂，且通过基因工程可大量生产，其作为降解剂的应用，可以理解，所说的应用可以具体是但不限于以下方式，如将糜蛋白酶添加于现有的蔬果清洗剂或清洁剂中、用糜蛋白酶来治理被有机杀虫剂污染的土壤和废水以及用糜蛋白酶对有机杀虫剂中毒的人、畜进行解毒等。本专利技术的有益效果体现在，提供了一种糜蛋白酶的新用途，为大规模应用于清除农产品表面的残留杀虫剂、治理被杀虫剂污染的土壤和废水、对杀虫剂中毒后人、畜的解毒提供新的途径。附图说明图1为重组原核表达质粒pET-32a(+)/NYD-Ch的构建示意图。图2为NYD-Ch在E.coli BL21(DE3)中表达、纯化的SDS-PAGE分析；其中M为蛋白分子量标准；1为空载菌对照；2为未诱导的NYD-Ch重组菌对照；3为诱导表达的NYD-Ch重组菌；4为纯化的NYD-Ch重组表达蛋白。图3为NYD-Ch重组蛋白的Western Blot鉴定分析；其中M为蛋白分子量标准；1为诱导表达的NYD-Ch重组蛋白；2为空载对照。图4为pH对NYD-Ch酶活力的影响。图5为NYD-Ch及其降解产物的GC分析；其中A为NYD-Ch；B为溴氰菊酯；C为NYD-Ch与溴氰菊酯作用后的降解产物。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例1淡色库蚊糜蛋白酶(NYD-Ch)对溴氰菊酯的降解作用1)采用基因重组法，构建NYD-Ch原核表达载体并诱导表达根据淡色库蚊糜蛋白酶基因全长序列(参见GENBANK登记号AF468495)设计引物上游引物L5′-CGGAATTCAACATGGCATCGAAACTGACGGT-3′下游引物R5′-ACTAGCGGCCGCTTA AGCATCCTGACGCAGCTG-3′在上游引物中引入EcoR I酶切位点(GAATTC)，并且在酶切位点的上游引进保护性碱基CG；下游引物中引进Not I酶切位点(GCGGCCGC)，其外侧引进保护性碱基ACTA，从而保证内切酶的酶切效率。采用PCR方法扩增NYD-Ch全长序列(813bp)，构建原核克隆载体pGEM-T/NYD-Ch，构建示意图如图1所示，PCR和测序鉴定无误后通过双酶切，将目的基因片断亚克隆至表达载体pET-32a(+)中，构建原核表达载体pET-32a(+)/NYD-Ch并转化至感受态菌BL21(DE3)中。将转化的重组菌用1mMIPTG在37℃诱导4小时以表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，考马斯亮蓝染色判断分子量大小。如图2所示，可知在50kD处有明显的表达蛋白，和理论上的NYD-Ch蛋白分子量一致。2)采用金属螯合亲和层析方法纯化NYD-Ch表达蛋白并鉴定表达产物经离心收集细菌总蛋白、超声破碎细胞后，用Ni-NTA纯化表达的目的蛋白。用Western blot方法鉴定特异性表达，如图3所示，可知NC膜上出现50kD的显色带，和预设的相当，空载对照组未见显色条带出现。3)采用酶促底物法，用特异性底物测定表达蛋白的活性选用BTEE和S(Ala)2ProPhe-pNA作为糜蛋白酶特异性底物，在不同pH下对NYD-Ch表达蛋白进行鉴定。将酶液与底物在pH为4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0的缓冲液中30℃反应20min，各对应的pH梯度分别以不加酶液的底物为对照，通过测定不同pH条件下的酶活力，确定酶的最适反应PH。如图4可知，NYD-Ch最大活力通过S(Ala)2ProPhe-pNA获得，酶的活力随着pH的增高而增大，在pH为8.00-11.0的范围内较高，在10.0时达最高。选用丝氨酸蛋白酶抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用。

【技术特征摘要】
1.糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用。2.根据权利要求1所说的糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用，其特征在于其中所说的有机杀虫剂是菊酯类杀虫剂3.根据权利要求2所说的糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用，其特征在于其中所说的菊酯类杀虫剂是溴氰菊酯杀虫剂。4.根据权利要求2所说的糜蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用，其特征在于其中所说的菊酯类杀虫剂是高效氯氰菊酯杀虫剂。5.根据权利要求1所说的糜蛋白酶作为有机杀...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱昌亮，孙艳，孙立新，马磊，钱瑾，沈波，张东辉，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]