胰高血糖素样多肽－１类似物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了胰高血糖素样多肽－１类似物及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了第５位，第６位，第３４位，第３５位和／或在第３７位进行修饰后的胰高血糖素样多肽－１类似物。本发明专利技术提供了该多肽的化学制备和分离方法和通过采用重组ＤＮＡ技术制备与纯化该多肽方法。该多肽在临床上可用于治疗２型糖尿病和肥胖症。本发明专利技术还提供了该多肽用于制备治疗２型糖尿病的缓释药物的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及胰高血糖素样多肽-1 (GLP-I)类似物及其制 备方法与应用。
技术介绍
目前，2型糖尿病由于发病率提高而成为世界性的疾病。2型糖尿病的发病机理非 常复杂，当前使用的治疗2型糖尿病药物有种种缺陷，最主要表现在长期使用引起患者的 体重增加，而且由于药物引起的细胞功能作用的逐渐损失使得患病加重。大约百分之 九十糖尿病患者为2型糖尿病，亦称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。2型糖尿病患者一 般仍然分泌胰岛素，但胰岛素无法由身体细胞有效地使用，因而无法降低血糖水平。胰高血糖素样肽1是机体正常的分泌多肽，由于对2型糖尿病的疗效显著并且能 克服现有药物的缺陷而成为倍受瞩目的治疗2型糖尿病的新型药物。胰高血糖素样肽I(GLP-I)发现于1984年，被认为是一种重要的肠降糖素 (incretin)。胰高血糖素样肽1是胰高血糖素原基因的产品.胰高血糖素样肽1是在摄食 时由肠道的L-细胞释放，并促进胰腺β -细胞释放胰岛素。胰高血糖素样肽1的作用不仅 在于刺激胰岛素的释放，还有众多的其它功能。目前普遍认为胰高血糖素样肽1不仅控制 血液葡萄糖而且通过几个其它作用控制2型糖尿病疾病的行进。在临床上，胰高血糖素样肽1被证明在降低血液葡萄糖是非常有效的，并且可用 在糖尿病的任意阶段。非常重要的发现是很少观察到低血糖的风险。其原因在于胰高血糖 素样肽1不同于磺酰脲降糖药(sulfonylureas)，只刺激葡萄糖诱导的胰岛素分泌。利用天 然胰高血糖素样肽1进行六周皮肤注射试验表明患者的体重也下降了。唯一已知的药物学 副作用是当在使用高剂量胰高血糖素样肽1时患者有恶心和呕吐。这些不必要的副作用可 由被禁止空腹使用而克服。并且，大多数临床数据表明，恶心只是短暂的，高效率的葡萄糖 控制能在没有这种副作用情况下实现。因而，从临床观点看，胰高血糖素样肽1可有效地降 下血液葡萄糖，较少低血糖症风险和阻止疾病发展的潜力，为治疗型2糖尿病的理想药物。目前有两类胰高血糖素样肽1化合物在进行临床开发。一类是天然胰高血糖素样 肽1。另一类是exendin-4，是一种从蜥蜴Heloderma Suspectum的毒液中分离的多肽。这 两类多肽结构同源性高达53 %。人类胰高血糖素样肽1是含有37氨基酸残基的多肽，来源于在回肠末端，由 胰高血糖素样肽原衍生而来。在L-细胞中，胰高血糖素样肽原被加工成胰高血糖素样 肽-1(7-36)-NH2、胰高血糖素样肽-1(7-37)和胰高血糖素样肽_2。具有功能的天然人类胰 高血糖素样肽1有两种形式胰高血糖素样肽-1 (7-36)-NH2，胰高血糖素样肽-1 (7-37)。胰高血糖素样-1 (7-36)NH2作为潜在治疗2型糖尿病药物拥有几个独特和有益 的效果。但是，由于被二肽酶IV(DPP IV)迅速水解和被肾脏迅速清除，天然胰高血糖素样 肽-1在体内作用的半衰期的极短，少于2分钟。有证据揭示其它水解酶，譬如中性肽链内 切酶(NEP)也降解胰高血糖素样肽1。因而阻碍了利用胰高血糖素样肽-1治疗2型糖尿病 研究发展。比较而言，exendin-4对DPP-IV和NEP水解有较强抵抗性，在人体中的半衰期在 DPP-IV控制后为26分钟。在Exendin-4类似物中，第八位的丙氨酸由Gly替代，尽管替换后 的胰高血糖素样肽-1轻微地减弱了与受体的亲和力，但对DPP IV更稳定。根据exendin-4 氨基酸序列，可以获得更多抗酶的多肽分子，但这些多肽分子也许引起免疫反应。 毋庸置疑，以胰高血糖素样肽1受体为目标的治疗的理想的方式是使用多肽化合 物衍生物。因而，新药物发现将是开发一种具有半衰期长而稳定的化合物。实验结果表明， 胰高血糖素样肽1肽的N-终端序列负责对胰高血糖素样肽1受体的核心部位的高亲合力 结合，其C-端负责选择性与受体的N-端相结合；丙胺酸扫瞄实验显示天然胰高血糖素样肽 1第7，10，12，13，15，28和29位的氨基酸对变异敏感。大量早期的研究在于瞄准设计抗蛋 白酶的胰高血糖素样肽1，以利用作药物。但是，这些胰高血糖素样肽1类似物还是无法被 用作为候选药物，因为它们被肾脏迅速地仍然清除。因而要求用其它形式提高多肽化合物 的某种延时性。就胰高血糖素样肽1而言，最大的挑战是这些肽类化合物必须注射。另一个更加 具体的挑战是一种成功的胰高血糖素样肽1药物应尽可能地减少对食道的副作用。这种药 物学副作用就是发生在药物浓度达到高峰时的恶心。根据与此相关联药物动力学的性质的 研究，长半衰期可以最好地避免恶心，因为长半衰期可以保证血浆中的最小给药量。大量临 床前和临床研究数据表明，胰高血糖样肽-1作为一种治疗非胰岛素依赖性糖尿病有巨大 的前景，特别是当口服药剂失败时尤为显著。此外，胰高血糖素样肽1的真正临床潜力在于降低葡萄糖，控制体重，并且控制病 情。胰高血糖样肽-1可诱导许多生物效应，譬如刺激胰岛素分泌，抑止胰高血糖素分泌，抑 止胃倒空，提高葡萄糖利用，并且导致减重。而且，目前的临床研究表明，胰高血糖样肽-1 可能阻止糖尿病伴随的β-细胞功能损伤的恶化进程。胰高血糖样肽-1的最明显的特征 是它能刺激胰岛素分泌但没有低血糖症风险，这种风险常见于胰岛素疗法或口服药物增加 胰岛素表达的治疗过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服天然胰高血糖素样肽-1在体内作用的半衰期极短的问 题，提供一种新的胰高血糖素样多肽-1类似物。新的衍生物比天然型具有更好的药物作 用；比天然型在血液中对DPP-IV更强的抵抗力，具有更长的持久性；也更容易制备。本专利技术的另一目的是提供上述胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法。本专利技术的进一步目的是提供上述胰高血糖素样多肽-1类似物在制备用于治疗2 型糖尿病的缓释药物中的应用。本专利技术的胰高血糖素样多肽-1类似物，具有如下氨基酸序列Xaa5-Xaa6-His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Arg-Xaa37或药物学可接受的盐；其中 Xaa5 是 Pro，Gly, Ac, NH2 或者缺失；Xaa6 是 Pro，Ala, Ser 或者缺失；Xaa8 是 Ala, β Ala，Gly, Cys, -NH-CH(CH3) -CH2-, -NH-CH2-CH2-, Cys (Acm)或者 Cys (SO3)；Xaa34是Lys或者Pro或者缺失；Xaa35是Gly或者Pro或者缺失；Xaa37 是 β Ala, Met, homoserine, Gly, Asp, NH2 或者缺失；但是，所述的胰高血糖素样多肽-1类似物不包括以下序列GLP-I (7-37) OH, GLP-I (7-36) NH2, Gly8-GLP-I (7-37) 0H,Gly8-GLP-I (7-36) NH2。本专利技术的胰高血糖素样多肽-1类似物具有同胰高血糖素样多肽-1 (GLP-1 (7-37) 0H)类似的氨基酸序列。GLP-I (7-37)OH的氨基酸序列见表1中的SEQ ID NO 本文档来自技高网...

【技术保护点】
胰高血糖素样多肽－１类似物，其特征在于：所述胰高血糖素样多肽－１类似物的氨基酸序列如下所示：Ｘａａ５－Ｘａａ６－Ｈｉｓ－Ｘａａ８－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｘａａ↓［３４］－Ｘａａ↓［３５］－Ａｒｇ－Ｘａａ↓［３７］或药物学可接受的盐；其中：Ｘａａ↓［５］是Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ａｃ，ＮＨ↓［２］或者缺失；Ｘａａ↓［６］是Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ或者缺失；Ｘａａ↓［８］是－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ↓［３］）－ＣＨ↓［２］－；Ｘａａ↓［３４］是Ｌｙｓ或者Ｐｒｏ或者缺失；Ｘａａ↓［３５］是Ｇｌｙ或者Ｐｒｏ或者缺失；Ｘａａ↓［３７］是βＡｌａ，Ｍｅｔ，ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ，Ｇｌｙ，Ａｓｐ，ＮＨ↓［２］或者缺失；但是，所述的胰高血糖素样多肽－１类似物不包括以下序列：ＧＬＰ－１（７－３７）ＯＨ，ＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ↓［２］，Ｇｌｙ↑［８］－ＧＬＰ－１（７－３７）ＯＨ，Ｇｌｙ↑［８］－ＧＬＰ－１（７－３６）ＮＨ↓［２］。

【技术特征摘要】
胰高血糖素样多肽 1类似物，其特征在于所述胰高血糖素样多肽 1类似物的氨基酸序列如下所示Xaa5 Xaa6 His Xaa8 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa34 Xaa35 Arg Xaa37或药物学可接受的盐；其中Xaa5是Pro，Gly，Ac，NH2或者缺失；Xaa6是Pro，Ala，Ser或者缺失；Xaa8是 NH CH(CH3) CH2 ；Xaa34是Lys或者Pro或者缺失；Xaa35是Gly或者Pro或者缺失；Xaa37是βAla，Met，homoserine，Gly，Asp，NH2或者缺失；但是，所述的胰高血糖素样多肽 1类似物不包括以下序列GLP 1(7 37)OH，GLP 1(7 36)NH2，Gly8 GLP 1(7 37)OH，Gly8 GLP 1(7 36)NH2。2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于所述类似物为通 过连接Xaa37和Xaa5形成的环状肽。3.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于所述类似物为通 过Cys5 二硫键形成的二聚体肽。4.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于所述类似物为 C-端酰胺化胰高血糖素样多肽-1类似物。5.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于所述胰高血糖素 样多肽-1类似物是由天然氨基酸合成。6.一种权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物的制备方法，其特征在于(1)将编码如下胰高血糖素样多肽-1类似物的氨基酸序列的DNA构建于蛋白表达质粒 PMFH ；前述氨基酸序列为以下述公式...

【专利技术属性】
技术研发人员：李弘剑，周天鸿，苏正定，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]