ＶＥＧＦ－１６５及ＨβＤ３双基因质粒载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种ＶＥＧＦ－１６５及ＨβＤ３双基因质粒载体及其构建方法，利用ｐＶＩＶＯ１－ｍｃｓ质粒载体系统，采用酶切重组的方式，将人牙龈组织中获得ＨβＤ３ｃＤＮＡ和白血病细胞（ＨＬ－６０）中获得ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ构建成重组质粒ｐＶＩＶＯ１－ｍｃｓ－ＶＥＧＦ１６５－ＨβＤ３。本发明专利技术将特异性促进上皮细胞增殖的ＶＥＧＦ和能抗细菌、抗真菌并能中和毒素的ＨβＤ３重组在同一载体上共同表达，将其应用于创伤愈合，既能促进创面上皮修复，又能增强创伤内环境免疫，达到“双管齐下”。本发明专利技术将在创伤愈合的基因治疗和组织工程研究领域发挥重要作用，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因治疗领域，具体地说，涉及可在基因重组技术中使用的质粒 载体及其构建方法；更具体地说，是涉及具有VEGF-165和Ηβ D3双基因真核表达重组质粒 载体及其构建方法。
技术介绍
随着社会经济的发展和工业化程度的日益提高，创伤与其他意外伤害所致的死亡 在我国已成为仅次于恶性肿瘤、心脑血管疾病、呼吸系统疾病的第四大死亡原因，在青壮年 中则占第一位。因此，深入开展创伤与创伤后组织修复的研究不仅是创伤医学深入发展的 需要，也是现代社会发展的重要需求。目前，对于颂面部及人体其它部位创伤的修复，特别 是大型组织缺失的创伤修复多采用“以创伤修复创伤”的治疗模式，虽然对局部创伤组织缺 失的修复起到明显的疗效，挽救了患者生命，创伤后一次性组织瓣移植修复创伤缺损也大 大缩短了患者的治疗时间，但是由于组织瓣的来源是患者身体其它部位的正常机体，术后 必定为供区带来新的创伤，留下新的瘢痕，甚至功能障碍，对患者术后的生活质量带来一定 的影响。如何以“无创修复创伤”的方式治疗这一疾病，是目前急待解决的课题。机体损伤后出现协调的愈合过程，其中包括多种细胞、细胞因子和细胞外基质之 间错综复杂的网络作用。细胞因子在创伤愈合过程中具有重要作用，它能调节创伤修复过 程中的多种细胞反应，影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等。在众多细胞因子中， 血管内皮生长因子(VEGF)是一重要的促愈合因子，免疫组化显示VEGF的表达主要位于上 皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的胞浆中，无论是在伤前组织还是伤后不同修复阶段的组 织中，VEGF均呈持续性阳性表达，提示VEGF在颂面部组织中具有较为丰富的来源，显示了 其所能发挥的作用。因此，我们特异性选择VEGF作为促进创面愈合的活性多肽，是较为理 想而可行的。对于创口中的感染采用抗菌素治疗是常用的方法，确能有效抑制或杀灭敏感细 菌，但抗菌素不能中和毒素、不能抵抗真菌，此外，尤其是广谱抗菌素还可加重机体内F常 生态菌群失调节器，更进一步削弱了机体内环境微生态屏障，形成新的感染诱发因素。研究 发现防御素(defensin)有明显的杀菌和抑菌作用，并有抗真菌和中和毒素的作用，其效果 与防御素量呈正相关，防御素在机体内抗感染方面具有独特的优点。防御素是机体抵御病 原微生物入侵的天然免疫的重要介质，人类β防御素(1 3)广泛表达于口腔组织，如口 腔粘膜、唾液腺、牙龈、舌等组织，在口腔上皮天然宿主防御反应中发挥重要作用。其中β 防御素_3相对于其它防御素对盐浓度不敏感，对多药抗药性的金色葡萄球菌和抗万古霉 素的粪肠球菌具有强大的杀菌作用，对革兰氏阳性菌杀伤力更强，并且不影响口腔内环境 微生态菌群，不伤害人体组织细胞，是理想的抗口腔内感染的活性抗菌肽。综上，本专利技术 针对人体软组织创伤临床发生率高，危害重，治疗难的科学问题，拟 优选VEGF-165和防御素-3为实现既促进创面上皮修复，又能增强机体免疫的协同治疗策 略解决问题，为有效治疗机体软组织创伤提供新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是构建一种人VEGF-165和人防御素3双基因重组质粒载体， 为基因治疗机体软组织创伤提供新的途径。本专利技术的目的之二 是提供上述重组质粒载体的构建方法。本专利技术的目的之一，主要通过以下技术方案实现VEGF-165和Hi3D3双基因质粒载体，其特征是所述的重组质粒载体包括人 VEGF-165 和人 H β D3 基因。 其中，VEGF-165基因序列如序列表1所述。Ηβ D3基因序列如序列表2所述。 pVIVOl-mcs质粒载体的结构图如表3所示，Ηβ D3基因插入到载体MCSl位点即968_974bp 区域，VEGF-165基因插入到载体MCS2位点即4085_4098bp区域。利用pVIVOl-mcs质粒载 体系统，构建成重组质粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3。本专利技术所用质粒载体pVIV01-mCS，是双基因共表达真核载体，宿主范围广，转染效 率和基因表达水平高，暂时性表达，安全性较好，是基因治疗的优良载体，应用于创伤愈合 和组织工程等较为理想。本专利技术的目的之二，主要通过以下技术方案实现一种VEGF-165和Ηβ D3双基因质粒载体的构建方法，主要包括以下几个步骤1)获得人VEGF-165和人Ηβ D3基因；2)用NcoI和EcoRI对H β D3DNA和质粒pVIVOl-mcs进行双酶切，采用粘端连接法 进行连接，获得重组质粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3 ；3)再用 BspHI 和 HindIII 对重组质粒 pVIVOl-mcs-Hβ D3 和 VEGF DNA 进行双酶 切，采用粘端连接法进行连接，得到重组质粒pVIV01-mcs-VEGF165-Hi3 D3 ；4)脂质体介导重组质粒转染293FT细胞，外源基因在细胞中表达。本专利技术具有如下技术效果1、本专利技术选择特异性促进上皮细胞增殖的血管内皮生长因子(VEGF)和能抗细 菌、抗真菌并能中和毒素的人类βΗβ 3(Ηβ 3)作为活性生物分子，将其克隆到多基因表 达载体pVIVOl-mcs中，并将其转染损伤粘膜区，使损伤局部表达分泌VEGF和H β D3，同时发 挥这两种基因的作用，促进创面愈合。动物实验充分证实VEGF和Hi3D3双基因疗法能够 加快口腔粘膜组织难愈性创伤的愈合。2、本专利技术在同一载体上搭载血管内皮生长因子(VEGF)和人类βΗβ 3(Ηβ 3)， 使基因转染后，两个外源基因共表达，协同发挥作用。同时多基因表达载体pVIVOl-mcs是 瞬时转染的，治疗后不会对机体产生长久的作用，从而避免了其它并发症的产生。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明图1是VEGF-165及Ηβ D3双基因质粒载体的结构示意图；图2获取的目的基因电泳图HL-I和HL-2均为从白血病细胞(HL60)中扩增出 hVEGF165cDNA基因片段，YY为从牙龈组织中扩增出Ηβ D3cDNA基因片段；图3重组质粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3NcoI和EcoRI双酶切鉴定图 4 重组质粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 双酶切鉴定电泳图 DL2000 和 DL15000 为Marker，P为空载体，VDP165为重组质粒，VDP165-D为重组质粒经Ncol、EcoRI双酶 切得到的Hi3D3cDNA基因片段，VDP165-V为重组质粒经AgeI、HindIII双酶切后得到 hVEGF165cDNA 基因片段；图5转染了重组质粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3的293FT细胞48h时明场下做 免疫荧光；图 6 转染了重组质粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 细胞 48h DAPI 下做免 疫荧光；图 7 转染了重组质粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 细胞 48h 绿光下 Ηβ D3 红色荧光抗体；图 8 转染了重组质粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 细胞 48h 蓝光下 VEGF 绿色荧光抗体。具体实施方式 1. 1材料手术中切除的患者牙龈组织由西南医院口腔科提供，白血病细胞HL-60 本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＶＥＧＦ－１６５及ＨβＤ３双基因质粒载体，其特征在于：所述重组质粒载体包括人ＶＥＧＦ－１６５ｃＤＮＡ，和人ＨβＤ３ｃＤＮＡ，其中ＶＥＧＦ－１６５ｃＤＮＡ基因序列为：ＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＴＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＡＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴＧＴＡＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＧＧＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＴ；ＨβＤ３ｃＤＮＡ基因序列为：ＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＣＧＴＧＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡ。...

【技术特征摘要】
1.VEGF-165及Hi3D3双基因质粒载体，其特征在于所述重组质粒载体包括人 VEGF-165cDNA，和人 H0D3cDNA，其中 VEGF_165cDNA 基因序列为CCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCGCCTTGCAACGCGAGTCTGT GTTTTTGCAGGAACATTTACACGTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGCTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGCCCACAGG GATTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATG TGCTGGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCC CTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGT ACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACT TCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAA GGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCAT ；H3D3cDNA基因序列为ATGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTGTTTTTGGTGCCTGTTCCAGGTCATGGAGGAATC ATAAACACATTACAGAAATATTATTGCAGAGTCAGAGGCGGCCGGTGTGCTGTGCTCAGCTGCCTTCCAAAGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张从纪，夏章权，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]