一种土拉弗朗西斯菌检测试纸制造技术

本实用新型专利技术公开了一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与含有胶体金标记的ＦｏｐＡ－Ｓ多克隆抗体的金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔抗重组ＦｏｐＡ－Ｌ多克隆抗体检测条带。本实用新型专利技术利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌，并可实现定量，适用于现场快速检测。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于生物检测领域，具体涉及一种土拉弗朗西斯菌检测试纸。
技术介绍
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis，Tula)简称土拉菌，该菌能引起“土拉 热”的人畜共患病，感染者会出现皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状，病情严重 甚至死亡。该菌具有分布广泛，传播途径多样，感染剂量低、致病性强等特点。注射lOcfu、 与皮肤接触10-50cfu、或摄入IO2-IO8Cfu该细菌都能导致土拉菌病感染。因此该细菌被列 为与鼠疫、炭疽等同列的A类恐怖源，已引起全世界的高度重视。《禁止化学武器公约》也将 土拉热也被列为最为严格的控制对象。生物安全问题已引起全球关注，美国疾病预防控制中心将土拉菌列为最有可能用 于生物武器的病原体。从国家生物安全战略高度看，我国境内，尤其是出入境口岸应加强对 土拉菌的反生物恐怖的研究。反生物恐怖的首要任务是迅速作出诊断，明确病原，以便及时 正确救治病人，减少继发性传播，迅速有效地控制和防治疫情的蔓延。胶体金标记的免疫层 析方法具有快速、简便、不需要依赖重要装备、能够实现现场检测等特点，成为目前传染病 快速诊断中研究的热点。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，其能快速、灵敏、特 异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌，适用于现场快速检测。为实现上述目的，本技术一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，包括反应支撑物、紧 密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分 重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与含有胶体金标记的i^opA-S多克隆抗体的金标抗体 保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜 上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔抗重组i^opA-L 多克隆抗体检测条带。进一步，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚酯膜或滤纸纤维。进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯膜或滤纸纤维。进一步，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有 样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。本技术的土拉弗朗西斯菌检测试纸，基于纯化的R)PA多抗标记胶体金，构建 双抗体夹心法检测抗原，具有操作简单，检测时间短，无需专业人员，适合快速现场检测等 优点。附图说明图1为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条的目测敏感性图；图2为特异性检测试验图；图3为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条模拟样品检测图；图4为本技术检测试纸的拟合直线图；图5A为本技术检测试纸的正面示意图；图5B为本技术检测试纸的侧面示意图；图6A为本技术检测试纸的阳性检测结果示意图；图6B为本技术检测试纸的阴性检测结果示意图；图6C为本技术检测试纸的无效检测结果示意图。具体实施方式如图1至图4，图5A、图5B、图6A、图6B、图6C所示，图1是土拉弗朗西斯菌胶体 金免疫层析试纸条的目测敏感性图，1-5分别表示检测的样品浓度依次为空白对照、75ug/ mL、7. 5ug/mL、750ng/mL、375ng/mL。如图 1 所示，75ug/mL、7. 5ug/mL、750ng/mL 为阳性反应； 375ng/mL无阳性反应；即肉眼可观察到的最低浓度为750ng/mL。图2为特异性检测试验图，1表示检测750ng/mL的马秋波GP2蛋白，2表示天花MlR 蛋白，3表示禽流感NP蛋白，4表示登革病毒Deng-E-D3蛋白，5表示普氏立克次体120N蛋 白。图3为土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析试纸条模拟样品检测；测试条1 阴性对 照、2 5 分别为含R)PA蛋白750ng/mL梨汁、面粉、饼干、果冻。图5A、图5B中，1 吸水垫；2 硝酸纤维膜，T 包被兔抗重组R)PA_L多克隆抗体检 测条带；C 包被羊抗兔IgG的质控条带；3 含有胶体金标记R)pA-S多克隆抗体的玻璃纤维 膜；4 样品垫；5 反应支持物。图6A、图6B、图6C是本技术的检测结果示意图；出现T、C两条线表示阳性； 只出现C 一条线表示阴性；T、C两条线均不出现表示无效。本技术采用胶体金标记，实质是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒 表面的包被过程。胶体金对蛋白质的吸附主要取决于PH值和蛋白质的最小稳定浓度，离子 浓度和蛋白质分子量等也影响二者之间的吸附。本技术发现在胶体金检测试纸条的制 备过程中PH值和离子浓度条件是关键，胶体金是一种很不稳定的胶体，通常认为，在pH值 等于蛋白质等电点或较高于等电点时吸附效果最好，而且易形成牢固的复合物来稳定胶体 金。此时蛋白质分子主要呈电中性，与胶体金颗粒相互静电吸引力较小，而蛋白质分子的表 面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，因此较易吸附于金颗粒的表面形成一个蛋白质 层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，使胶体金处于一个相对稳定状态。当PH值低于蛋白质 的等电点时，蛋白质主要带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易结合形成大的聚合物而失去 结合蛋白质的能力。PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互 排斥而不能互相结合。因此常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作为稳定剂来防 止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀。经本实验证明本系统采用牛血清白蛋白作为稳定剂，其 特异性、敏感性都很好。本实验经过多次条件摸索得出K+对整个胶体金检测系统的影响较 大，所以在选择抗体稀释液、样品处理液等都要避免引进Κ+，也可以采用透析去除K+。本技术提供一种方便、快捷地检测土拉弗朗西斯菌检测试纸，同时可利用金 标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该检测试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本实用新 型还涉及制备上述检测试纸的制备方法。本技术能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的土拉弗朗 西斯菌，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。一种方便、快捷地检测土拉弗朗西斯菌的方法，其中包括将待测标本与样品稀释 液混勻，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟 判读结果；所述检测试纸包括(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组R)pA-L多克隆抗体和质控抗体的检测条带 和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的R)pA-S多克隆抗体；(5)样品垫，采用含有吐温20的磷酸盐缓冲液对玻璃纤维素膜进行预处理；其中反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸，硝酸纤维膜依次包被羊抗兔IgG、兔 抗重组R)pA-L多克隆抗体lmg/ml，金标抗体保护膜为含有胶体金标记的R)pA-S多克隆抗 体的玻璃纤维膜或聚酯膜或滤纸纤维，样品垫选用玻璃纤维膜或聚酯膜或滤纸纤维。本技术土拉弗朗西斯菌检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体保护 膜、样品垫和反应支持物按照附图5A所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2 位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗重组R)pA-L多克隆抗体检测条带，并且C 处是羊抗兔IgG包被的质控条带；玻璃纤维膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种土拉弗朗西斯菌检测试纸，其特征在于，该检测试纸包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的上表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有质控抗体包被的质控条带、靠近其末端处设置有兔抗重组ＦｏｐＡ－Ｌ多克隆抗体检测条带。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，景滢滢，王振东，杨宇，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]