本发明专利技术公开了一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。本发明专利技术的制备方法包括废水培养基调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验。本发明专利技术是一条减轻淀粉废水对环境污染、变废为宝的有效途径，同时可大大降低微生物灭蚊剂的生产成本。本发明专利技术所制备的灭蚊剂产品对环境安全无害，对淡色库蚊或白纹伊蚊２－３龄幼虫的生物毒效不低于１００ＩＴＵ／ｍｇ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种灭蚊剂，具体地说，涉及一种利用淀粉废水制备的微生物灭蚊剂及其制备方法。
技术介绍
淀粉废水是一种在淀粉加工过程中产生的高浓度有机废水，这些废水中含有大量的残余淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖等碳水化合物、蛋白质与有机酸等，易腐败发臭，COD通常在2000-20000mg/L之间，是食品工业中污染最严重的废水之一。淀粉加工的主要原料是玉米(约占80％)、薯类、小麦以及其它富含淀粉的植物块根，废水主要来源于浸泡与淀粉分离工段。我国现有淀粉生产企业近600多家，废水年排放量超过1亿吨。淀粉废水中所含的有机物大多是可以回收利用的宝贵资源。例如，玉米淀粉废水一般含有0.3-0.7％的总糖，约2.1％粗蛋白与0.1-0.3％的脂肪酸；目前，国内外常用的淀粉废水处理方法有生物处理法(包括活性污泥法、生物膜法、生物稳定塘与厌氧生物法等)、蛋白分离法(包括重力沉降法、化学絮凝法、气浮法与膜分离法等)以及微生物转化法。其中微生物转化法最受青睐，它是利用废水含有的丰富营养物质可支持菌体生长的特点，将之转化成附加值较高的产品。微生物转化法处理淀粉废水生产单细胞蛋白的技术早在上世纪70年代就被广泛应用，采用的菌种主要有白地霉、假丝酵母、光合细菌等，产品形式较为单一，主要为单细胞蛋白(SCP)饲料。这类SCP饲料存在一些缺陷如核酸含量高(食用过多可能会引起痛风等疾病)、无肉质、风味不佳而限制了其应用范围。因此，有必要寻找新型微生物转化技术，开发新型高附加值产品。球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus，简称Bs)与苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)是当前应用最广泛、杀灭蚊幼虫最有效的微生物灭蚊剂。它们对非靶生物与人畜无毒(可用于饮用积水)，同时也不破坏生态平衡和污染环境，已被世界卫生组织(WHO)推荐作为防蚊控病的重要手段之一。Bti与Bs主要杀蚊活性成分是代谢过程中产生的毒素蛋白，毒素蛋白被幼虫吞食后在肠道碱性环境中溶解，被蛋白酶降解激活，攻击蚊幼虫中肠刷状缘上皮细胞膜，杀伤这些细胞，最终导致蚊幼死亡。Bs与Bti微生物灭蚊剂的主要生产工艺是液体深层发酵，以黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、蛋白胨、牛肉膏、胨化牛奶等为主要原料，原料成本约占总生产成本的20-35％。目前，制约Bti与Bs两种微生物灭蚊剂大规模应用的主要因素有二一是生产原料昂贵。造成产品价格较高，抵消了其作为生物灭蚊剂的优越性；二是发酵水平低。这两种芽孢杆菌，尤其是Bs在发酵中往往不能同步成熟，发育同步性能差(普遍报道抗热性芽孢的形成率只有48-72％)，导致产品的杀蚊活性不高。近年来，有研究者尝试采用廉价的农副产品或有机物含量丰富的有机废弃物作为原料发酵生产微生物灭蚊剂。例如，Dharmsthiti等(1985)利用味精工业产生的有机废液(经水解预处理)作为主要培养基发酵生产Bti灭蚊剂，发酵罐试验表明，经过24-48h的通气搅拌培养，发酵液中Bti菌数达2.5×109个细菌/mL，对埃及伊蚊幼虫(Aedes aegypti)的LC50为0.063ppm，显著高于常规的合成培养基。Obeta等(1983)利用猪血、豆科植物种籽和矿质盐制备的几种培养基，发现在这些培养基中Bs 1593菌株都能良好的生长与产孢产毒，从而制备Bs灭蚊剂。然而，这些原料比较分散，并且通常需要繁琐、昂贵的预处理(如水解、浸提与浓缩处理等)，因而并未得到大规模的实际应用。淀粉废水含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质。2006年，专利技术专利(CN1799363A)公开了一种淀粉废水生产苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，该专利以苏云金杆菌为发酵菌种，所生产的苏云金杆菌微生物杀虫剂的防治对象是鳞翅目农业害虫。蚊类属于双翅目卫生害虫，它不仅吸血扰人，而且传播多种严重疾病。经文献与专利检索，尚未发现淀粉废水制备微生物灭蚊剂的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种灭蚊效果好，对环境安全无害的微生物灭蚊剂。本专利技术的另一个目的是提供上述微生物灭蚊剂的制备方法。在灭蚊剂制备过程中同时处理淀粉废水。为了实现上述目的，本专利技术采用液体深层发酵方法，包括如下步骤1)废水培养基调理调节淀粉废水含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。2)摇瓶培养从保藏正常的Bs或Bti斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时。牛肉膏蛋白胨液体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，自来水1000mL；pH 7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用Bs与Bti菌株是WHO推荐或厂家普遍使用的高毒力菌株。具体来说，Bs包括2362、1593、2297、Bs-10等4种，Bti是指苏云金芽孢杆菌H14血清型，主要是187与1897菌株，上述菌株可在国内微生物保藏机构直接购得。3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1.0-3.0％，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时。4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bti或Bs种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的适宜发酵时间为30-36小时，Bti菌株的适宜发酵时间为36-42小时。5)发酵液后处理发酵结束后，用无机酸将发酵液pH调为4.0-4.5，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为2-5倍，浓缩液加入0.2-2g/L防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。所述的无机酸是指硫酸、盐酸与硝酸，其中最好是盐酸；所述的防腐剂是指山梨酸钾、苯甲酸钠、二甲苯、尼泊金甲酯，其中最好是山梨酸钾。6)产品质量检验产品中抗热性芽孢的测定方法采用无菌操作，将液体产品进行梯度稀释，取适宜稀释度的菌液于80℃水浴处理15min，然后进行涂布培养计数，每平板菌落数30-300个有效。产品生物毒力效价测定方法按照WHO标准程序进行，试虫为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)或白纹伊蚊(Aedesalbopictus)二龄末至三龄初的健康幼虫。合格产品中抗热芽孢数≥109个/毫升，生物测定毒力效价≥100ITU/mg。g/L是指每1L培养基液体中加入的同标物的克数；％是指每100份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数。本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用淀粉废水制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤：（１）废水培养基调理：调节淀粉废水的含固率为２．０－８．０％，加入０．２－１．５ｇ／Ｌ磷酸氢二钾、０．２－１．０ｇ／Ｌ硫酸镁和１．０－５．０ｇ／Ｌ消泡剂，用碱调ｐＨ为７ ．５－１０．０，搅拌均匀后，灭菌，冷却至３０－３５℃备用；（２）摇瓶培养：将Ｂｓ或Ｂｔｉ接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为：温度２８－３２℃、转速１５０－２５０转／分，瓶装液量２０－４０％，培养时间８－ １２小时；（３）种子罐发酵：将Ｂｓ或Ｂｔｉ摇瓶菌液移入种子罐，接种量为１－３％，进行发酵培养，培养条件为：罐温２８－３２℃、罐压０．０２－０．０６ＭＰａ、每分钟的通气量为培养基体积的１．０－１．５倍、搅拌速度２００－２６０转／分、发 酵时间８－１２小时；（４）发酵罐发酵：按１－１０％的接种量将Ｂｓ或Ｂｔｉ种子液移种到发酵罐，培养条件为：罐温２８－３２℃、罐压０．０２－０．０６ＭＰａ、每分钟的通气量为培养基体积的１．０－１．５、搅拌速度１８０－２２０转／分、发酵时 间３０－４２小时，其中Ｂｓ菌株的发酵时间为３０－３６小时，Ｂｔｉ菌株的发酵时间为３６－４２小时；（５）发酵液后处理：发酵结束后，用无机酸将发酵液ｐＨ调为４．０－４．５，然后用高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为２－５倍，浓缩液加入０．２ －２ｇ／Ｌ防腐剂，搅拌均匀，分装，得到微生物灭蚊剂液体产品。...
【技术特征摘要】
1.一种利用淀粉废水制备微生物灭蚊剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)废水培养基调理调节淀粉废水的含固率为2.0-8.0％，加入0.2-1.5g/L磷酸氢二钾、0.2-1.0g/L硫酸镁和1.0-5.0g/L消泡剂，用碱调pH为7.5-10.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却至30-35℃备用；(2)摇瓶培养将Bs或Bti接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃、转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间8-12小时；(3)种子罐发酵将Bs或Bti摇瓶菌液移入种子罐，接种量为1-3％，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5倍、搅拌速度200-260转/分、发酵时间8-12小时；(4)发酵罐发酵按1-10％的接种量将Bs或Bti种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的1.0-1.5、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时，其中Bs菌株的发酵时间为30-36小时，Bti菌株的发...
【专利技术属性】
技术研发人员：周顺桂，雷发懋，王跃强，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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