肺炎球菌多糖结合疫苗制造技术

本发明专利技术提供了采用新方法生产的一种新的结合疫苗，其含有经过部分水解的高度纯化的由与免疫载体蛋白连接的肺炎链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）类（Ｐｎ）产生的荚膜多糖（Ｐｓ）。该结合蛋白可用于防止肺炎球菌的感染。含有１至１０种不同肺炎球菌多糖免疫蛋白（Ｐｎ－Ｐｓ－ＰＲＯ）结合物的疫苗可以广泛地诱导受体对产生多糖成分的同类病原体的保护性免疫应答。通常对Ｐｎ－Ｐｓ不能产生保护性免疫应答的儿童和２岁以下的婴儿通过接种这些Ｐｎ－Ｐｓ－ＰＲＯ结合物能产生保护性免疫应答。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
根据细菌的荚膜多糖(Pn-Ps，作为病原菌的肺炎链球菌(Streptoc-occus pneumoniae)(pneumococci，Pn)已经分为84种抗原血清型。由这些病原菌引起的疾病包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症和慢性支气管炎的急性转剧、窦炎、关节炎和结膜炎。但是这些疾病的优势却由84种已知分离物中有限的几种菌引起的。因此，含有由非常流行的这些病原菌分离物得到的Pn-Ps的多价疫苗，能够对这类报导很多的比例很高的病原体提供保护。已经生产的多价疫苗对成年人中的肺炎球菌能够有效地产生保护性免疫应答。例如“PNEUMOVAX 23”(多价肺炎球菌疫菌MSD;参阅PDR，1990年版第1431页)是含有23种不同的未结合的肺炎球菌多糖(每种含量50μg/ml)的液体组合物，这些菌种全部保藏在ATCC，并且为本专利技术的原料提供一条可能得到的途径。“PNEUMOVAX 23”含有下述各种游离的未结合的多糖1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19F，19A，20，22F，23F和33F，含量约为90%肺炎球菌血液分离物。但是这些疫苗在很大程度上对肺炎球菌感染疗效很差，仍冒着危险性，例如B细胞免疫协调的个体，依赖于T细胞免疫保护应答的中年以上的人和2岁以下的婴儿。由于未结合的多糖是T细胞免疫应答的极差诱导物，所以将Pn-Ps转化为能够诱导T细胞应答的免疫原，在这项任务中产生充分保护作用的关键。但是，使用并不限于这类对象。例如将含有一种或多种新结合物的疫苗在导致母体中产生抗体的受孕前或怀孕期间施用于雌性哺乳动物，从而能被动保护发育中的胎儿和喂奶期的婴儿，致使疫苗不直接施用于胎儿或婴儿。这种结合物还证明可用于诱导产生最大限度地被动保护受威胁群体(例如受感染的新生婴儿或同胞)的抗体。现已证明，本身免疫性很差的多糖一旦与免疫蛋白(PRO)相结合，就能成为极好的免疫原(参阅Marburg et al.，美国专利4695624;Schneerson et al.，New Dev.，with Hum＆Vet.Vaccines，77-94，1980;Schneerson et al.，J.Exptl.Med.，152，361，1980;Anderson，Infection and Immunity，39，233，1983)。但是，生产这类结合物的主要问题在于多糖原料的粘必和不均匀性，因此难于在化学上限定结合产物。于是需要提供一种方法，其中原料尽可能是已知的，而且每一步合成路线都可测定所形成的中间体。本申请公开的方法由于提供了对产生Pn-Ps的同类病源体具有很高免疫性的结合免疫原，从而满足了上述要求。该结合物可用于2岁以下的婴儿。Marburg等(J.Am.Chem.Soc.，108，5282，1986)和美国专利4695624、4830852、4882317介绍了一种方法，即通过属间空间将多糖与免疫蛋白结合。衍生物的PRO具人亲核或亲电子基团(PRO＊)，而其中的Ps则具有相反的反应作用的基团(Ps＊)。通过Ps＊与PRO＊的结合，使Ps与PRO连接在一起(Ps-PRO)形成属间空间。通过酸水解，属间空间释放出异常的氨基酸，经氨基酸定量分析，从而提供证明共价结合的方法。本专利技术公开了改进美国专利4695624、4830852和4882317所介绍的方法，该改进包括Pn-Ps原料比Pn-Ps粗制品具有更高的特异性、重现性和处理性的物理性质，包括增加溶解度、过滤度、纯度(降低族特异性C多糖(C-Ps)的污染)和降低分子量、多分散度和粘度。与美国专利4695624相比，生成本申请所公开的结合物，在增加稠度、制备难度、增加最终产品抗原力和纯度等诸方面都有了改进。特别显著的是与美国专利4695624中的预结合Ps制剂相比，本专利技术在Pn-Ps预结合中，族特异性C多糖和肽聚糖降低3-20倍。虽然C多糖污染的存在并不影响对类型特异性抗原的免疫应答，但是在结合反应中沉淀出的C-Ps使其对类型特异性Ps的特异性和可控性降低。此外，抗C多糖抗体的产生与在某些尚未解决的肺炎球菌感染中所观察到的组织分解有关。除了新结合产物外，本专利技术还公开了制备部分水解的高度纯化的肺炎球菌多糖中间产物的新方法、含有1至10种不同结合物的新组合物和使用本专利技术的方法。具有特殊意义的是包含在“PNEUMOVAX 23”中的荚膜多糖Pneumococcal Vaccine Polyvalent，MSD;参阅PDR，1990 edition，p.1431)。最佳的例子是肺炎链球菌(Streptococcus pneumo-niae)亚型6B、23F、19F、14、18C、4和9V的荚膜多糖，这一小类肺炎球菌亚型都能解决婴儿和儿童中75-85%肺炎球菌的感染。本专利技术提供的方法还可用于广泛收集各种肺炎球菌和其他细菌的多糖。在化学上能高度限定的肺炎球菌多糖(Pn-Ps)的制备方法是将Pn-Ps制剂粗制品部分水解至预定的终点，保持Pn-Ps的抗原整体性。将经过部分水解的Pn-Ps基本纯化后，用于Pn-Ps免疫蛋白(PRO)结合物(Pn-Ps-PRO)的制备。本专利技术的新的高抗原Pn-Ps-PRO结合物含有外膜蛋白复合物(OMPC)或脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)b或其重组的或纯化的亚单位，例如MIEP，或与由一般的肺炎链球菌分离物产生的经部分水解并高度纯化的Pn-Ps中间体共价结合的其他免疫载体，这种结合在哺乳运动体内可用于预防肺炎球菌感染。尤其可在哺乳运动、特别是B细胞免疫损害的个体、中年以上的人和2岁以下的婴儿中用于刺激抗肺炎球菌免疫应的疫苗组合物，这种结合物还可刺激T细胞应答。制备Pn-Ps-OMPC和Pn-Ps-MIEP结合物的方法包括下述步骤由肺炎链球菌的培养物中分离出荚膜Ps，部分水解或物理切变Pn-Ps，分离所述的Pn-Ps，得到分子大度、多分散度、粘度都减低的Pn-Ps产物，然后将Pn-Ps与OMPC或MIEP共价结合。本专利技术的目的之一在于提供新的、经部分水解并高度纯化的具有抗原类型特异性的肺炎球菌荚膜多糖(Pn-Ps)，该多糖可作为中间体用于制备Pn-Ps和免疫原蛋白的T细胞依赖的结合物。本专利技术的目的之二在于提供Pn-Ps和免疫原蛋白的T细胞依赖的结合物，将其用于疫苗组合物，以预防肺炎球菌的感染，尤其是2岁以下的婴儿和B细胞免疫损伤的人。本专利技术的目的之三在于提供优于美国专利4695624介绍的制备肺炎球菌多糖-免疫原蛋白共价结合(Pn-Ps-PRO)的方法，其中所述的改进包括原料Pn-Ps、中间体、最终产物的具有更高的化学限定、稠度提高，并且方法又易于实施。本专利技术的目的之四在于根据本专利技术的改进方法，提供在化学上予以限定的Pn-Ps-PRO结合物，显示T细胞的依赖性，将这种结合物用于诱导抗病原体肺炎球菌的保护性血清抗体，尤其是用于2岁以下的婴儿和免疫损害者。本专利技术的目的之五在于提供一种治疗方法，即在疫苗配制剂中使用免疫有效量的这些结合物，以预防肺炎球菌诱发的名种疾病，例如中耳炎、脑膜炎、肺炎、菌血症和慢性关节炎的急性转剧、窦炎、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有与由一种或多种肺炎链球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）亚型产生的多糖共价连接的免疫蛋白的结合物，所述多糖的每个分子均具有大约１２００重复单位，分子量约为１×１０↑［５］至１×１０↑［６］，多分散度为１．０至１．４，由肺炎球菌族特异性Ｃ－多糖造成的污染低于３．０％类型特异性多糖。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PJ尼斯肯，A哈戈皮恩，WJ米勒，叶基础，小JP亨尼西，DJ库贝克，PD伯克，S马堡，RL托尔曼，
申请(专利权)人：麦克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]