一种神经细胞传递信息功能的定性和定量评估方法技术

本发明专利技术具体涉及一种神经细胞传递信息功能的定性和定量评估方法，其中，所述的定性评估方法是，先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别进行磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明该神经细胞具有传递信息的功能；所述的定量评估方法是，先分别制备含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬液，再分别置于超声破碎仪中破碎细胞膜后，使用等离子体质谱仪分别检测含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水重悬液中的锰含量，然后计算出二者锰含量的比值，此值越大则表明该神经细胞传递信息的功能越强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物物质功能的测试方法，具体涉及神经细胞感受刺激和传导兴奋功 能的评估方法。
技术介绍
神经系统的基本功能是信号传导或信息传递，其基本单位是神经细胞，即神经元。 神经元(Neuron)是一种高度特化的细胞，是神经系统的基本结构和功能单位之一，它具有 感受刺激和传导兴奋的功能，所以对其的观察和评估具有重要意义。例如对一些神经元样 细胞功能的观察和评估可以协助判断这些细胞是仅仅结构类似神经元还是功能上具备神 经元的功能；对神经细胞功能的观察还可以评价不同的病理条件或药物等干预条件对神经 细胞功能活动的影响；研究神经系统发育和神经细胞分化过程也都涉及到对其功能的观察 评估。目前，神经细胞的信号传导或信息传递功能的检测主要依赖细胞膜片钳技术，该 技术通过玻璃微电极的尖端与单个细胞膜接触，以观测细胞膜离子通道的微小电流。然而 在测定某种神经细胞膜离子通道电流时尚存在一些技术上的难题。首先，在体外培养的细 胞群体中并非每个细胞都具备活性，具备空间上的随机性，从数以百万计的体外培养细胞 群体中选择可能发生膜电流变化的某个细胞以用来观察十分困难；其次，即使选中作为观 察对象的这个细胞具备产生离子通道电流的能力，这种电流改变往往是瞬时发生和消失 的，具备时间上的随机性，如何捕获这种瞬时的电流在观测时间点的选择上更是难上加难； 另外，即使观测时该细胞发生了离子通道电流改变，在电流程度非常微弱的情况下很难捕 捉到信号。因此，对神经细胞功能作出准确的评估，需要另辟蹊径，寻求新的评估方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种不受神经细胞功能 活动随机性影响的神经细胞的信号传导或信息传递功能的评估方法。本专利技术解决上述问题的技术方案一如下一种神经细胞传递信息功能的定性评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别 进行磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝 胶的磁共振图像较含未造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明这种神经细胞 具有传递信息的功能；其中，所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法由以下步骤组成(1)先往DMEM/F12培养基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经 细胞接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增 至神经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下 培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱导5天； (2)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基 中浓度为0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为 ΙΟμπιοΙ/L 并作用 24h ； (3)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/L 胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养 基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至 另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分 离，去除上清液，如此重复3次之后，于40°C下加入浓度为60g/L 80g/L的琼脂糖凝胶水 溶液重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法是，依次执行所述的含造影的神 经细胞冷冻凝胶的制备方法的步骤(1)和步骤(3)即可。本专利技术所述的定性评估方法，其中所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法 的步骤(2)中所述的氯化锰和谷氨酸是分别用去离子水溶解后再加入培养瓶中的。本专利技术解决上述问题的技术方案二如下一种神经细胞传递信息功能的定量评估方法，该方法由以下步骤组成先分别制备含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水 重悬液，再分别置于超声破碎仪中，超声作用5s，停5s，持续5min破碎细胞膜后，使用等离 子体质谱仪分别检测含造影的神经细胞去离子水重悬液和含未造影的神经细胞去离子水 重悬液中的锰含量，然后计算出二者锰含量的比值，此值越大则表明这种神经细胞传递信 息的功能越强；其中，所述的含造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法由以下步骤组成(I)先往DMEM/F12培养基中添加10 %的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经 细胞接入所述含血清培养基中，然后置于温度为37°C、C02浓度为5%的培养箱中培养，扩增 至神经细胞浓度为3 X IO5个/mL后移至培养瓶中，在温度为37°C、C02浓度为5%的条件下 培养24小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为10 μ g/L的NGF诱 导5天；(II)加入NGF诱导5天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基 中浓度为0. 05mmol/L 0. lmmol/L,再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为 lOymol/L 并作用24h ；(III)然后倾倒去除培养基，加入DPBS缓冲液冲洗3遍，再加入ImL浓度为2. 5g/ L胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含10 %的胎牛血清的DMEM/F12培养 基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入DPBS缓冲液重悬后移至 另一试管中离心分离，去除上清液后再加入DPBS缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分 离，去除上清液，如此重复3次之后，加入去离子水重悬至神经细胞浓度为1 X IO6个/mL ；所述的含未造影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法是，依次执行所述的含造 影的神经细胞去离子水重悬液的制备方法的步骤(I)和步骤(III)即可。本专利技术所述的定量评估方法，其中所述的含造影的神经细胞去离子水重悬液的制5备方法的步骤(II)中所述的氯化锰和谷氨酸都是先用去离子水溶解后再加入培养瓶中 的。本专利技术所述的两种评估方法，其中，所述的定性评估方法是将神经细胞扩增、诱导 后加入氯化锰和谷氨酸，使神经细胞在谷氨酸的下刺激而开放钙离子通道，让含氯化锰溶 液中的锰离子进入神经细胞内，冰浴凝固后进行磁共振图像，并将所得到的图像与未加造 影剂的神经细胞的磁共振图像进行对照，如果图像得到增强便说明这种具有传递信息的功 能，检测结果稳定且直观。所述的定量评估方法是将神经细胞扩增、诱导后加入氯化锰和谷 氨酸，使神经细胞在谷氨酸的下刺激而开放钙离子通道，让含氯化锰溶液中的锰离子进入 神经细胞内，然后再超声破碎细胞膜，使用等离子体质谱仪检测锰含量，并将所测得的锰含 量与未加造影剂的神经细胞的锰含量进行比较，当二者锰含量的差值越大则表明这种神经 细胞传递信息的功能越强，不仅可对神经细胞传递信息功能进行数字化定量评估，而且结 果稳定、精确。附图说明图1为在相差显微镜下观察到的经培养和诱导的PC12细胞的生长状态图。图2为在荧光显微镜下观察到的经培养和诱导的PC12细胞的免疫组化染色图。图3为不同浓度氯化锰造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振成像，按照左右上下顺 序分别为空白凝胶、无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经细胞传递信息功能的定性评估方法，该方法由以下步骤组成：先分别制备含造影的神经细胞冷冻凝胶和含未造影的神经细胞冷冻凝胶，再分别进行磁共振功能成像，然后将二者的磁共振图像进行对照，如果含造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像较含未造影的神经细胞冷冻凝胶的磁共振图像增强，则表明该神经细胞具有传递信息的功能；其中，所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法由以下步骤组成：（１）先往ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基中添加１０％的胎牛血清，得到含血清培养基，再将神经细胞接入所述含血清培养基中，然后置于温度为３７℃、ＣＯ２↓［浓］度为５％的培养箱中培养，扩增至神经细胞浓度为３×１０↑［５］个／ｍＬ后移至培养瓶中，在温度为３７℃、ＣＯ↓［２］浓度为５％的条件下培养２４小时后，往所述的培养瓶中加入在所述含血清培养基中的浓度为１０μｇ／Ｌ的ＮＧＦ诱导５天；（２）加入ＮＧＦ诱导５天后，往培养瓶中加入氯化锰，使其在所述含血清培养基中浓度为０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ～０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，再加入谷氨酸，使其在所述含血清培养基中浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ并作用２４ｈ；（３）然后倾倒去除培养基，加入ＤＰＢＳ缓冲液冲洗３遍，再加入１ｍＬ浓度为２．５ｇ／Ｌ胰酶的水溶液消化神经细胞，待贴壁细胞回缩后加入含１０％的胎牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基终止消化，然后移至试管中，离心分离，去除上清液；接着，加入ＤＰＢＳ缓冲液重悬后移至另一试管中离心分离，去除上清液后再加入ＤＰＢＳ缓冲液重悬并移至一新的试管中，离心分离，去除上清液，如此重复３次之后，于４０℃下加入浓度为６０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶水溶液重悬至神经细胞浓度为１×１０↑［６］个／ｍＬ迅速插入冰浴凝固；所述的含未造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法是，依次执行所述的含造影的神经细胞冷冻凝胶的制备方法的步骤（１）和步骤（３）即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜晓丹，法志强，王志娟，张鹏，张润，李鹏，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]