本发明专利技术公开了一种石斑鱼ＭＨＣ ＩＩＢ基因及其克隆方法和应用。本发明专利技术石斑鱼ＭＨＣ ＩＩＢ基因的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。本发明专利技术通过同源克隆的方法，从石斑鱼中分离得到ＭＨＣＩＩＢ基因，鉴定出１２种不同的ＭＨＣ ＩＩＢ基因型，对ＭＨＣ ＩＩＢ基因的多态性和抗病力之间的相互关系进行了分析，筛选出与石斑鱼抗病相关的ＭＨＣＩＩＢ基因的６种分子标记，适用于石斑鱼抗病相关标记的筛选和抗病品种的选育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种石斑鱼MHC IIB基因及其克隆方法和 应用。
技术介绍
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是在脊椎动物中普遍存在的一类编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群，该基因群在免疫系统中 具有重要作用，是近年来免疫方向研究的热点之一。MHC基因分为I型、II型和III型， II型基因又分为IIA和IIB。MHC II类基因编码产物是MHC II类分子，它们与外源性抗 原肽结合并递呈给T辅助细胞，引起下游的免疫应答。许多研究表明，MHCII基因的多 态性与个体的抗病能力密切相关。MHC II类分子是一个异源二聚体，由一条α多肽链和一条β多肽链组成。这 两条链都由两个核外区(α1/α2*β1/β2)、一个结合区、一个跨膜区和一个胞浆区组 成。α 1/β 1组成多肽结合区(Peptide Binding Region，PBR),具有高度多态性，其作用是与抗原分解成的小肽结合，以将其递呈给T细胞；α 2/β 2组成的区域不具有高度多态 性，是MHC分子与T细胞结合的重要结构域。MHC II类分子具有高度多态性，尤其是在其多肽结合区 (peptide-bindingregion, PBR),该区域直接与抗原裂解成的抗原肽产生作用，进而引起 下游的免疫级联反应。MHC II的等位基因通常在PBR区域存在较高比例的非同义替换 (non-synonymous Substitution)。事实上，MHC在脊椎动物中是所有已知基因中表现出最 高多态性的一个基因，在人类的研究中发现仅一个基因座上就有超过500个等位基因。 MHC基因通过平衡选择来保持其多态性，MHC基因在遗传上具有连锁不平衡(linkage disequilibrium)和单元型(Haplotype)遗传两个特点。MHC分子的高度多态性具有深远的意义，它赋予种群适应多变的环境条件的能 力，实现对机体免疫应答的遗传控制，并使MHC成为个体的终身遗传标志。MHC的多 态性亦与个体抗病能力息息相关，在鸡、哺乳类、鱼类中都已发表MHC多态性与机体抗 病力相关性研究的文章。MHC多态性在系统进化的研究、种群保护的研究和遗传育种等 方面都是一个极其重要的材料，是当今MHC基因研究的一个热点。鱼类MHCII的α和β基因一般是连锁遗传的。目前已在超过30种硬骨鱼类中 克隆得到MHC基因并证明了其多态性，如斑马鱼、鲤鱼、大西洋鲑、牙鲆、条纹石鯧、 真鲷等。鱼类MHC基因功能与哺乳类相同，参与抗原递呈引起免疫级联反应。研究表 明，鱼类MHC基因中编码PBR结构域的基因片段(通常为MHC基因上的第二个外显子) 亦具有高度多态性，且与鱼类的免疫抗病能力密切相关。Kj0gIum等将7个家系约2000 尾的大西洋鲑以5种MHC I等位基因和4种MHC II等位基因组合并结合传统家系选育方 式筛选针对ISA(传染性贫血病)的抗病群体，成功筛选出有效的抗病基因型组合，这开创了使用MHC进行鱼类抗病辅助育种的先河。此后，在牙鲆、鲤鱼中也有类似研究被报 道。目前，国内外尚无任何关于石斑鱼MHC基因的研究被报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中对MHC基因的研究尚未完全的问题，提供 一种与石斑鱼抗病相关的石斑鱼MHC IIB基因。本专利技术另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因上的等位基因。本专利技术另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因编码的蛋白。本专利技术另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的克隆方法。本专利技术另一目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的序列多态性的检测方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述石斑鱼MHC IIB基因的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种石斑鱼MHCIIB基因，其序列如SEQ ID NO: 1所示，该基因是通过同源克隆的方法从斜带石斑鱼脾脏中分离得到的。所述基因中至少存在12个不同的等位基因， 其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。上述石斑鱼MHC IIB基因所编码的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO 2所示， 共249个氨基酸，等电点为6.53，分子量为28.31千道尔顿，石斑鱼MHC IIB蛋白主要 分为4个结构域，分别是Exonl编码的信号肽(SP)、Εχ0η2编码的多肽结合区(即β 1 结构域，PBR)、Εχοη3编码的IGcl区(即β 2结构域)与Εχοη4和部分Εχοη5编码的 跨膜区。石斑鱼MHC IIB基因所编码的蛋白与大菱鲆、真鲷、虹鳟、斑马鱼、小鼠和人 MHC IIB基因所编码蛋白的同源性分别为74.0%、79.1%、58.4%,。55.2%、32.0% 和 31.5%。本专利技术石斑鱼MHC IIB基因的克隆方法包括如下步骤(1)提取石斑鱼总RNA，反转录得到CDNA第一条链，制备RACE PCR反应模 板；(2)根据不同物种MHC IIB的氨基酸序列的同源性设计简并引物，得到石斑鱼 MHC IIB基因的cDNA片段；所述简并引物的序列如SEQ ID NO 15 16所示；(3)根据所得片段设计引物进行RACE PCR,所述引物序列如SEQ IDNO: 17 22 所示，获得 1338bp 的 MHC IIB 全长 cDNA ；(4)根据与石斑鱼亲缘关系相近鱼类的已知MHC IIB外显子和内含子的分界位 点设计引物，进行内含子扩增，得到石斑鱼MHC IIB的全基因序列，所述引物如SEQ ID NO 23 30所示。本专利技术石斑鱼MHCIIB基因多态性研究，根据石斑鱼MHC IIB基因的第一外显 子上合成特异性上游引物EpcoMHC2bPl_F，序列如SEQ ID NO: 31所示，在第二外显子 的末端和第二内含子前端合成特异性下游引物EpcoMHC2bH_R，序列如SEQ ID NO: 32 所示；在45条不同石斑鱼个体中进行PCR扩增，挑取145个阳性克隆并送测序后，得到 MHC IIB基因PBR区域多态性的原始数据。测序结果表明，MHC IIB基因在石斑鱼中存 在两个不同位点，其分子量大小差异在于Intran 1的长度不同。其中一个位点的Intranl 大小为138bp，命名为DAB2;另一位点的Intronl大小在不同鱼种差异很大，但总是大于138bp，命名为DAB 1。在45条鱼145个阳性克隆中共存在12个不同序列，这表明在石 斑鱼MHC IIB基因中至少存在12个不同的等位基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 3 14所示。其中10个等位基因属于DABl位点，2个等位基因属于DAB2位点。将10个 属于DABl位点的等位基因命名为EpcoDAB*l_01到EpcoDAB*l_10，将2个属于DAB2 位点的等位基因命名为EpcoDAB*2-01和EpcoDAB*2_02。上述石斑鱼MHC IIB抗病相关标记筛选，采用自然选择和人工感染途径获得 抗病群体和不抗病群体。在发病旺季，从养殖场收集发病后存活的个体，同时用病原 菌感染收集来的鱼苗，根据对病原菌感染的抵抗存活能力大小获得抗病群体和不抗病群 体。总共对81个个体的321个阳性克隆进行了测序，结果表明，有6种MHC基因型 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种石斑鱼ＭＨＣ ＩＩＢ基因，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，易诗白，王磊，张海发，卢丹琪，李水生，蒙子宁，刘晓春，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。