弯曲菌疫苗制造技术

本发明专利技术涉及含有抗无鞭毛弯曲菌菌株之抗血清、可用于预防动物体内弯曲菌定居的疫苗，在空肠弯曲菌蛋白印迹中所述蛋白印迹膜与抗空肠弯曲菌无鞭毛突变体抗体温育后可见、而与抗野生型空肠弯曲菌抗体温育后不可见的弯曲菌抗原性蛋白，并涉及它们在疫苗及其生产中的用途。本发明专利技术还涉及包含这些蛋白和抗这些蛋白之抗体的疫苗，这些弯曲菌蛋白的用途，抗弯曲菌抗原之抗血清和抗体在疫苗制备中的用途，以及制备这些疫苗的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗弯曲菌定居的疫苗、弯曲菌蛋白和弯曲菌抗体在制备这种疫苗中的用途以及制备这种疫苗的方法。弯曲菌属的细菌为革兰氏阴性螺旋形致病菌，具有较强的运动能力并在其细胞的一端或两端带有鞭毛。目前已发现好几种弯曲菌。空肠弯曲菌常见于家禽。猪群中常见大肠弯曲菌，最近还(在较小范围内)发现猪肠弯曲菌。空肠弯曲菌是这些弯曲菌中最常分离到的与人类腹泻有关的弯曲菌。越来越多的证据表明人体中弯曲菌的感染比沙门菌的感染更多见。(Griffiths等，用途细菌学杂志(Journ.of Applied Bacteriology)1990，69281-301，Walker等，微生物学评论1986，5081-94，Butzler，J-P.，ISBN 0-8493-5446-3，RIVM报告号216852002，Bilthoven，荷兰)。人的弯曲菌感染难以避免，因为首先弯曲菌是来自食物的人畜互传细菌，很多动物，不管是野生的还是家养的，也不管是健康的还是患病的，其体内都可能大量带菌。此外，该细菌有多种不同的传播途径。它们可在诸如屠宰后的畜体表面及水中以球形休眠形式存活好几星期。因而该细菌极易通过直接与动物接触或经污染的水源或食物如牛奶或肉类而传染至人类。空肠弯曲菌可见于很多健康动物，如火鸡或小鸡之类的禽类、牛、绵羊、马和啮齿动物。鸡肉，作为全世界很多国家的重要营养来源，已知经常受到弯曲菌的污染(Shane(1992)，S.M.，鸟类病理学21189-213)。不仅发展中国家如此，欧洲也不例外。弯曲菌定居在家禽肠道中。在屠宰场中将常常严重污染了弯曲菌的肠道从动物体内除去时常发生肉类的污染。屠宰过程中的污染很难避免。在荷兰，尽管肉类行业采用了较高的卫生标准，仍有50％的鸡肉被污染。C.M.Karssen的论文(ISBN 90-71463-72-9)对家禽中弯曲菌的流行病学作了最新回顾。由于污染的情况如此严重，仅在荷兰(总人口15,000,000)每年就有约300,000人因接触或吃了未煮透的禽肉而感染弯曲菌。其它欧洲国家的这类数据也大同小异。据估计全世界每年发生超过400,000,000例的感染(Pace等，疫苗1998，161563-1574)。弯曲菌引起人体肠道的感染，偶尔还导致更为严重的疾病如流产、脑膜炎、盲肠炎及尿路感染。(Blaser等，新英格兰医学杂志1981，3051444-1452，Butzler等，临床肠胃病学1979，8737-765)。有时还引起严重的神经性并发症如急性热病性多神经炎和Miller-Fisher综合征(Schwerer等，1995，内毒素研究杂志2395-403和Salloway等，1996，感染与免疫642945-2949)。弯曲菌所致腹泻常为自限性感染，病程约2-7天。在幼龄儿童、老人和免疫受损患者中，此病不是自限性的，必需抗生素治疗。很显然，若有了抗弯曲菌的有效人用疫苗，就可阻止弯曲菌感染人。但这将要求类似抗腮腺炎和麻疹之免疫接种的标准接种程序。显然这是不现实的。更合理方法是避免动物向人，特别是家禽向人的传播。最简易的方法是免疫接种家禽以抵抗弯曲菌感染。然而家禽的免疫接种(就象人类免疫接种一样)实施起来比最初预料的要复杂得多。原因是弯曲菌尽管定居于家禽的肠道却对家禽不致病。已检验的大多数疫苗是灭活的全细胞制品，经全身给药或口服，有时与佐剂联合使用。部分情况下肠道的定居在一定程度上可减少，但无一例疫苗可避免定居。这些疫苗无一例可阻止弯曲菌的排出。全细胞灭活疫苗若与亚单位疫苗比较，则是疫苗的首选，因为原则上它们仍具有全部潜在的免疫原性决定簇。继全细胞疫苗的开发之后，很多努力集中在基于鞭毛的亚单位疫苗的开发上。鞭毛是感染期间被识别的免疫显性抗原，多项研究均显示此蛋白有保护作用(Martin等，感染和免疫1989，572542-2546，Wenman等，临床微生物学杂志1985，21108-112)。已知无鞭毛的突变体不定居肠道，而且它们在一或两周后从感染动物体内消失，而此时野生型细菌仍留在肠道中。因此鞭毛是制备疫苗的最佳选择，尤其因为在肠道定居方面它们所起的作用即使不是唯一的也是关键的。如果能阻止定居，将迈出消除家禽污染的第一步。尽管如此，基于弯曲菌鞭毛的潜在疫苗尚不能提供足够的保护。继上述主动免疫接种之后，被动免疫接种作为减少弯曲菌感染的一个方法也受到检验。Tsubokura等(1997，临床实验免疫学108451-455)施行口服抗空肠弯曲菌全细胞的抗体，然后用空肠弯曲菌攻击。他们声称经此免疫的小鸡粪便中发现的细菌数减少了1-2个对数级。迄今所作的所有努力尚未能找到一种能明显减少定居水平及粪便中排出的细菌量的活性、灭活或基于亚单位的疫苗。显然仍有必要寻找可靠而安全的疫苗或其它治疗方法。原则上，无需在家禽的一生中保护它不受弯曲菌感染。如上所述它们并无感染的痛苦。所以，能减少细菌量并因此减少屠宰前的感染机率的治疗方法将能有效抑制屠宰时的后继肉类污染。而这就能预防由肉类传播的人弯曲菌感染。本专利技术的目标之一是提供能减少定居水平及排出量、或甚至能从家禽的盲肠清除弯曲菌的疫苗。这可避免屠宰时发生肉类的弯曲菌污染并因此避免随后的人类污染。现已惊讶地发现，具有这些特征的疫苗可基于抗弯曲菌之无鞭毛突变体的抗体。这是大大出乎人们预料之外的，因为如上所述，鞭毛已被认为是与粘附和定居有关的关键蛋白。更令人惊讶的是，这种疫苗确实减少了野生型有鞭毛弯曲菌的定居和排出。这是首次报道疫苗甚至能将盲肠中的弯曲菌清除至检测水平以下。因此，本专利技术的一个实施方案涉及预防弯曲菌在动物体内定居的疫苗，该疫苗包含抗弯曲菌无鞭毛菌株的抗血清。这样的疫苗可以非常简单地包含新分离的抗弯曲菌抗血清，或许还有稀释剂。可加入这样的稀释剂以使效价过高的抗血清得到稀释。稀释剂可以简单地采用蒸馏水或生理盐水溶液。事实上任何药学可接受的稀释剂均可使用。本专利技术在猪和其它动物的弯曲菌感染中与在家禽的感染中同等适用。由于鸡肉污染率极高，该实施方案的一个优选形式涉及无鞭毛的空肠弯曲菌菌株，并涉及家禽。任何无鞭毛弯曲菌菌株均可用于制备抗血清。尤其优选那些生长率与野生型菌株相当的无鞭毛弯曲菌菌株。制备抗体的无鞭毛弯曲菌最佳菌株之一已由Wassenaar，T.M.，Bleumink-Pluym，N.M.C.和van derZeijst，B.A.M.于1991年述于EMBO杂志102055-2061。因此，在一个优选形式中，用来生成抗体的无鞭毛空肠弯曲菌菌株为R2。适于本专利技术疫苗的抗体可得自多克隆血清、单特异性血清或单克隆抗体培养物。多克隆血清的优势在于可按常规技术简便制备。生产和加工多克隆血清的技术最为领域内熟知(如Mayer和Walter，编，细胞和分子生物学中的免疫化学方法，Academic出版社，伦敦，1987)。适于制备抗体的动物包括如牛、兔子、小鼠和小鸡。获得抗弯曲菌之牛抗体的有效方法已由Hilpert等1987年述于传染病杂志156158-166。生产大量抗体的另一个有效方法即在卵黄囊中的生产已述于Hatta等，1993，生命科学、生物技术及生物化学57450-454。本专利技术的另一实施方案涉及针对空肠弯曲菌无鞭毛菌株的抗体在制备抗空肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
预防动物体内弯曲菌定居的疫苗，其特征在于该疫苗包含针对无鞭毛弯曲菌菌株产生的抗血清。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AAC扎科布斯，JF范登伯施，PJM纽坦，
申请(专利权)人：阿克佐诺贝尔公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]