用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的ＲＴ－ＰＣＲ方法技术

本发明专利技术公开了一种用于南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的ＲＴ－ＰＣＲ方法，本发明专利技术根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的ＲＮＡ，设计出特异性的引物，并借助引物对待鉴定病毒的ＲＮＡ模板进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，并将ＰＣＲ产物电泳成像，根据ＰＣＲ产物经电泳后显示结果阳性与否，来实现对宿主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染的快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒物种检测技术，具体涉及南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的快速检测技术。
技术介绍
南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)和百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)三种病毒是侵染百合和唐菖蒲的主要病原物，给种植者带来较大的经济损失。南芥菜花叶病毒寄主范围广泛，可以侵染约174属215种植物，自然侵染并危害多种花卉、瓜类、豆类和果树，引起花叶、黄化褪绿、矮化、皱缩甚至坏死等症状，为我国规定的进境植物检疫性有害生物。BYMV病毒寄主广泛，主要寄主为唐菖蒲等观赏植物和豆科植物。受BYMV侵染的唐菖蒲幼苗生长势减弱，叶片出现白色碎斑，花杂色，导致切花质量下降，种球产量减少，而受BYMV侵染的蚕豆，种传率4％～17％，田间发病率可高达67％～100％，造成59％～96％的产量损失。百合受LSV的侵染率高达73％，其单独侵染时一股无明显症状，在自然条件下常与其它病毒复合侵染，导致百合叶片严重花叶和整株矮化，影响百合的产量和商业价值。工作人员利用实时RT-PCR检测技术对侵染百合和唐菖蒲的三种主要病原物(南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒)检测时，需要做三次检测实验，速度慢，因此需要改进。
技术实现思路
本专利技术所要解决的是南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的检测速度慢的技术问题。解决上述问题采用如下技术方案：用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，包括如下步骤：a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；b、以RNA溶液作为模板，进行RT-PCR反应，得到PCR产物；在RT-PCR反应体系中包括引物；其中引物共三组，分别为ArMV引物、BYMV引物和LSV引物，分别具有如下序列：ArMV上游引物：5′-CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3′，ArMV下游引物：5′-TTCCAAATCCCACATTACCT-3′，BYMV上游引物：5′-AACCCACCACAAGATGACA-3′，BYMV下游引物：5′-GACGGATACTCTAAATACGAACA-3′。LSV上游引物：5′-ATGAAGGTTGGCGTCGTA-3′，LSV下游引物：5′-TATTCGGTTTCCTGGCTC-3′，ArMV引物、BYMV引物、LSV引物分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作；-->c、对PCR产物进行电泳；d、观察电泳结果是否显示阳性；e、根据观察结果是否显示阳性，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。进一步的，e步骤还包括将观察结果与南芥菜花叶病毒阳性对照、菜豆黄花叶病毒阳性对照和百合无症病毒阳性对照进行对照的步骤；其中，南芥菜花叶病毒阳性对照是以南芥菜花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有691bp的扩增产物，具有如下序列：CAAGTTTCTGACTATCCCACCACTGGAATATGACCTGAGTACTACCAGTGCCTACAAAAGTGTGTCCCTTCTTTTGGGCCAAACTCTTGTTGATGGGACTCATAAAGTGTATAATTATAATAATACACTTTTGAGTTACTATCTTGGTGTTGGTGGTGTGGTCAAGGCAAAGTGCATATATGTAGCCCTTGTACTTATGGCATAGTCCTAAGAGTTGTTAGTGAATGGAATGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTAAATACCCCGGGTGTTATATCGATGAGGATGGGAATTTTGAAATTGAAATTCTTCCCCATATCATCGAACTCCACTGCGCTTACTGGATGGACAGGCAGCGAGCTCTTTCACGAGCACGTGAATTTCTATGCAATTTCGGGGCCAATTGCCCCGAGTGGAGAAACTGCTAAGATGCCAGTGGTAGTGCAAATTGACGAAATTGCATTACCAGATCTTTCCGTCCCGACTTTCCCTAATGATTATTTTCTTTGGGTGGACTTTTCTGCTTTCACTGTTGATACAGAAGAGTATGTAATAGGGTCGAGGTTTTTTGATATTTCCTCTACCACTAGTACTGTCGCCCTGGGAGATAATCCTTTTGCCCACATGATAGCTTGTCATGGGCTCCATTGCGGAGTTCTTGATCTTAAGGTAATGTGGGATTTGGAA；菜豆黄花叶病毒阳性对照是以菜豆黄花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有592bp的扩增产物，具有如下序列：AACCCACCACAAGATGACATTTCAAATGTTATAGCAACACAAGCACAGTTTGAAGCATGGTACAATGGTGTCAAACAAGCATATGAGGTTGAAGATTCAACAGATGGGAATTATTCTGAATGGCCTTATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGCACATCAGGAGATTTACAAGGTGAATGGACAATGATGGATGGAGAGGAGCAGGTGACATACCCTTTAAAACCTATCTTGGACAATGCATAAGCCAACATTCCGCCAAATAATGTCACATTTCTCGGAAGTTGCGGAAGCACCTACATTGGAAAAGCGAGGAATGCAACAGAGAGGTACATGCCACGGTATGGGCTTCAGAGGAACCTAACTGAATTATGGGCTTGGCTAGATATGCTTTTGACTTCTACAAGCTGACTTCAAAAACTCCTGTACGTGCTAGGGAAGCACACATCGCAAATGAAGGCGGCAGCAGTTAGGGGCAAGTCAACCCGATTATTTGGACTTGATGGCAATGTTGGAACAGACGAGGAGAACACAGAGAGACACACAGCAGGAGATGTCAATCGTGATATGCACACCATGCTTGGTGTTCGTATTTAG；百合无症病毒阳性对照是以百合无症病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有521bp的扩增产物，具有如下序列：-->ATGAAGGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCAAGATAGCGTCAGACATTGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCATCAGTAATATTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCGGCGTTCCTTGACCCTGAGGGCAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCGCTGCGATCATGAAGAAGCACGCTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的ＲＴ－ＰＣＲ方法，其特征在于，包括如下步骤：ａ、从寄主上抽提出待检测病毒的总ＲＮＡ；ｂ、以ＲＮＡ溶液作为模板，进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，扩增得到ＰＣＲ产物；在ＲＴ－ＰＣＲ反应体系中包括引物；其中引物共三组，分别为ＡｒＭＶ引物、ＢＹＭＶ引物和ＬＳＶ引物，分别具有如下序列：ＡｒＭＶ上游引物：５′－ＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＣＣＣＡＣＣ－３′，ＡｒＭＶ下游引物：５′－ＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴ－３′，ＢＹＭＶ上游引物：５′－ＡＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＣＡ－３′，ＢＹＭＶ下游引物：５′－ＧＡＣＧＧＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＴＡＣＧＡＡＣＡ－３′，ＬＳＶ上游引物：５′－ＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＡ－３′，ＬＳＶ下游引物：５′－ＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣ－３′，ＡｒＭＶ引物、ＢＹＭＶ引物、ＬＳＶ引物分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作；ｃ、对ＰＣＲ产物进行电泳；ｄ、观察电泳结果是否显示阳性；ｅ、根据观察结果是否显示阳性，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；b、以RNA溶液作为模板，进行RT-PCR反应，扩增得到PCR产物；在RT-PCR反应体系中包括引物；其中引物共三组，分别为ArMV引物、BYMV引物和LSV引物，分别具有如下序列：ArMV上游引物：5′-CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3′，ArMV下游引物：5′-TTCCAAATCCCACATTACCT-3′，BYMV上游引物：5′-AACCCACCACAAGATGACA-3′，BYMV下游引物：5′-GACGGATACTCTAAATACGAACA-3′，LSV上游引物：5′-ATGAAGGTTGGCGTCGTA-3′，LSV下游引物：5′-TATTCGGTTTCCTGGCTC-3′，ArMV引物、BYMV引物、LSV引物分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作；c、对PCR产物进行电泳；d、观察电泳结果是否显示阳性；e、根据观察结果是否显示阳性，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。2.根据权利要求1所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，步骤d还包括将观察结果与南芥菜花叶病毒阳性对照、菜豆黄花叶病毒阳性对照和百合无症病毒阳性对照进行比较的步骤。3.根据权利要求2所述的用于检测南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的RT-PCR方法，其特征在于，南芥菜花叶病毒阳性对照是以南芥菜花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有691bp的扩增产物，具有如下序列：CAAGTTTCTGACTATCCCACCACTGGAATATGACCTGAGTACTACCAGTGCCTACAAAAGTGTGTCCCTTCTTTTGGGCCAAACTCTTGTTGATGGGACTCATAAAGTGTATAATTATAATAATACACTTTTGAGTTACTATCTTGGTGTTGGTGGTGTGGTCAAGGCAAAGTGCATATATGTAGCCCTTGTACTTATGGCATAGTCCTAAGAGTTGTTAGTGAATGGAATGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTAAATACCCCGGGTGTTATATCGATGAGGATGGGAATTTTGAAATTGAAATTCTTCCCCATATCATCGAACTCCACTGCGCTTACTGGATGGACAGGCAGCGAGCTCTTTCACGAGCACGTGAATTTCTATGCAATTTCGGGGCCAATTGCCCCGAGTGGAGAAACTGCTAAGATGCCAGTGGTAGTGCAAATTGACGAAATTGCATTACCAGATCTTTCCGTCCCGACTTTCCCTAATGATTATTTTCTTTGGGTGGACTTTTCTGCTTTCACTGTTGATACAGAAGAGTATGTAATAGGGTCGAGGTTTTTTGATATTTCCTCTACCACTAGTACTGTCGCCCTGGGAGATAATCCTTTTGCCCACATGATAGCTTGTCATGGGCTCCATTGCGGAGTTCTTGATCTTAAGGTAATGTGGGATTTGGAA；菜豆黄花叶病毒阳性对照是以菜豆黄花叶病毒的RNA为模板、经引物扩增得到的具有592bp的扩增产物，具有如下序列：AACCCACCACAAGATGACATTTCAAATGTTATAGCAACACAAGCACAGTTTGAAGCATGGTACAATGGTGTCAAACAAGCATATGAGGTTGAAGATTCAACAGATGGGAATTATTCTGAATGGCCTTATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGCACATCAGGAGATTTACAAGGTGAATGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑耘，陈枝楠，陈富华，李一农，杨伟东，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]