含有LTB佐剂的疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种疫苗，该疫苗包含至少一种颗粒状免疫原和辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的Ｂ亚单位。更具体地讲，本发明专利技术涉及一些疫苗，其中辅助性ＬＴＢ没有污染Ａ亚单位或全毒素。为此，优选使用通过重组ＤＮＡ技术制备的ＬＴＢ。颗粒状免疫原可以涉及或者可以来源于例如病毒、细菌或真菌。一旦粘膜（例如鼻内）给药，该疫苗就特别适合于诱导针对所说颗粒状免疫原的保护性应答。已发现这种给药导致针对颗粒状免疫原涉及的病原体的全身和粘膜两者的保护作用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种疫苗，该疫苗含有作为粘膜免疫佐剂的大肠杆菌(E．coli)热不稳定性肠毒素的B亚单位(LTB)。本专利技术具体地说涉及预防人类的流感的这种类型的疫苗。但是，本专利技术并不局限于在流感疫苗中的应用。针对传染病的免疫接种的目的是经过引入来源于具体病原体的抗原制剂、通过刺激对传染物的免疫应答，预防或至少限制被接种者的感染。理想地，诱导的免疫应答应当由两部分组成、即体液应答(产生抗原特异性抗体)和细胞应答(产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，该细胞能够清除由病原体感染的细胞)。许多的接种过程都涉及将含有灭活的或减毒的整个病原体的制剂给药。但是对某些病原体而言，用整个病原体接种存在着相当多的缺点，这是因为这种制剂可能具有不希望有的副作用，即使它们通常是高度免疫原性的。这就解释了目前倾向于使用明确的亚单位疫苗或合成疫苗的趋势，这实质上去掉了整个传染物的不利的副作用。但是与整个病原体相比，至少在缺乏附加的佐剂的情况下，亚单位疫苗或合成疫苗常常是极少有免疫原性的。佐剂是与抗原结合给药以便刺激对该抗原的免疫应答的物质或材料。需要一些合适的佐剂，其中所述佐剂将会促进对亚单位抗原或合成抗原的免疫应答，同时不造成不希望有的副作用。流感疫苗的制剂已经长时间地含有、并且在某些情况下仍含有灭活的或减毒的整个病毒。这种制剂可能具有相当大的副作用，其中最突出的是发烧和在注射部位的反应。如今，通常用亚单位制剂进行接种。这种造成副作用更少的亚单位疫苗仅含有以近乎纯化形式存在的所述病毒的两种主要的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。在大多数目前的疫苗制剂中，并不存在附加的佐剂。灭活的或减毒的整个流感病毒疫苗以及亚单位疫苗通常是通过单一的肌内(i．m．)注射进行给药的。通过其中之一的接种过程实现的对流感的预防是相当低的，尤其在老年人当中更是如此。对流感接种的功效相当低的原因部分是由于病毒具有高度的抗原变异性。但是，有理由相信通过刺激和／或改变对抗原的免疫应答可以改善通过接种疫苗对流感的预防。在流感或者一般说来在通过呼吸道感染传染病的情况下，用于改善接种功效的策略的目的应当在于不仅在循环系统中产生足够的依赖T-细胞的免疫球蛋白G的应答，而且还应当在肺和鼻腔中产生局部的免疫应答(分泌性免疫球蛋白A)以作为抵御入侵的传染病毒的第一道防线。而且，细胞的免疫应答(细胞毒性的T-细胞)可能也是重要的，尤其是在限制传染的过程中更是如此。已经表明通过肌内注射(通用的给药途径)将流感疫苗给药并没有导致在呼吸道中产生局部的免疫球蛋白A的应答。本专利技术涉及这样一种惊人的发现相对于用不含佐剂的免疫原疫苗进行肌内免疫接种而言，在鼻内疫苗制剂中LTB的存在不仅刺激了循环系统中免疫球蛋白G的应答，而且在呼吸道中产生了局部的免疫球蛋白A的应答。完整的热不稳定的肠毒素(LT)及其关系密切的霍乱毒素(CT)是由一个A亚单位和一个五聚体环状结构组成的，其中五聚体环状结构是由五个相同的B亚单位组成的。A亚单位具有酶促ADP-核糖基化活性并且认为毒性活性是由毒素引起的。在肠上皮细胞中，A亚单位诱导第二信使cAMP不断地合成，从而造成过量的电解质以及随之而来的流体分泌到消化道腔中。LT和CT是有效的粘膜的免疫原。当进行局部的粘膜给药时，这些分子不仅导致诱导了定向于所述毒素的系统抗体应答，而且导致产生了局部的分泌型抗体，其中最突出的是分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)。LT和CT也是有效的粘膜的免疫佐剂。即当与其它不相关的免疫原共同给药时，LT或CT能够刺激针对该免疫原的系统和粘膜的抗体应答。但是迄今为止，LT和CT的毒性已经基本上排除了LT或CT在人的疫苗制剂中的使用。为了试图使LT或CT的毒性与免疫刺激活性分离开，已经检测了该毒素去毒的突变体或未修饰的分离的五聚体B亚单位(分别为LTB或CTB)的免疫佐剂的活性。显然，由于该毒素有毒的ADP-核糖基化的活性残留在A亚单位中，因此在人的疫苗中甚至存在痕量的未修饰的A亚单位或者存在LT或CT的全毒素都是非常不受欢迎的。Tamura及其同事已经研究了LTB作为流感抗原的佐剂的用途(Hirabashi等人《(疫苗》8243-248；Kikuta等人《疫苗》8595-599；Tamura等人《免疫学杂志》3981-988；Tamura等人《疫苗》12419-426；Tamura等人《疫苗》121083-1089)。在这些研究中，在使用可溶的流感病毒血凝素(HA)疫苗的基础上确认当与可溶的HA抗原结合经鼻内给小鼠给药时，不含A亚单位的LTB缺少粘膜的免疫佐剂的活性，其中所述的HA疫苗是根据Davenport等人(《实验室与临床医学杂志》63(1)5-13)报道的通过用吐温／醚处理从流感病毒中提取和纯化的。进一步表明痕量全毒素的存在、例如在从全毒素分离出的B亚单位制剂中剩余的残留的全毒素恢复了针对可溶HA抗原的LTB的佐剂活性的表达。更具体地讲，当使用来自重组来源(并因而完全没有甚至是最少的痕量的A亚单位)的LTB时，为了当与可溶的HA抗原经鼻内共同给药时使LTB发挥粘膜的活性，必须加入痕量的全毒素。令人吃惊的是发现了从重组来源分离的并因而完全不含A亚单位的LTB具有有效的免疫佐剂的活性，而该活性取决于鼻内共同给药的免疫原的性质或存在形式。例如，针对自由混合的小的可溶抗原(诸如卵清蛋白或人免疫缺损病毒包膜糖蛋白的可溶的胞外域(gp120))的佐剂活性是很低的并且常常是检测不到的。另一方面发现针对自由混合的大的聚集的或颗粒状免疫原，LTB发挥了非常有效的佐剂的活性。这些免疫原包括流感病毒亚单位抗原和匙孔血蓝蛋白(KLH)。因此，本专利技术涉及一种疫苗，该疫苗含有至少一种颗粒状免疫原和辅助量的完全不含A亚单位或有毒的LT全毒素的LTB。正如本文定义的那样，“颗粒状”是指以各微生物特征性病毒、细菌或真菌抗原的任何缔合物。更具体地讲，术语“颗粒状免疫原”包括集结体、簇合物、微团(micelles)、病毒体、玫瑰花结、类似病毒的免疫原颗粒等。在本专利技术的疫苗中，具体地说来可以采用由重组DNA技术制得的LTB。所述的一种免疫原或多种免疫原可以来源于传染物，如病毒或细菌。发现适用于上述的疫苗不仅在粘膜(例如鼻内)给药时诱导产生了针对免疫原的全身性免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G)，而且还发现该疫苗诱导了免疫球蛋白A的局部的分泌。这一在后的特性对预防某些疾病而进行免疫接种来说是特别有利的，其中所述的疾病是通过由病毒(如流感病毒、疱疹病毒、乳头状瘤病毒)、细菌(类似衣原体、肺炎链球菌)或真菌的粘膜感染来传播的。粘膜给药的一个特别的优点是使疫苗的使用容易，而且还回避了接受鼻内免疫接种的被接种者对针潜在的恐惧。尽管例如在流感的情况中高的血清免疫球蛋白G的滴度对防止病毒在系统中的扩散以及保护肺部以防感染来说是重要的，但是局部的S-IgA抗体作为保护上呼吸道的第一道防线是至关重要的。已经报道了在缺少粘膜佐剂的情况下通过鼻内将灭活的流感病毒给药而进行的粘膜免疫接种并不成功(Clancy《药物》50587-594；Katz等人《传染病杂志》175352-369)，这可能是因为将抗原直接向粘膜组织给药并没有导致S-IgA的应答。粘膜佐剂的共同给药似乎是诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗，所述疫苗含有至少一种颗粒状免疫原和辅助量的大肠肝菌特征性热不稳定肠毒素的Ｂ亚单位（ＬＴＢ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E阿吉斯特里比，R布兰德斯，L德哈罕，GJM范萨伦伯格，WR沃威，JC威尔舒特，
申请(专利权)人：杜菲尔国际开发有限公司，格罗宁根大学，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]