本发明专利技术公开了一种猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ、相应的前体、反义寡核苷酸及其应用。本发明专利技术猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１～３所示的任意一条序列；与本发明专利技术猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ相应的前体序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～６所示；与本发明专利技术猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ相应的反义寡核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９所示。本发明专利技术猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ均克隆自猪蛔虫成虫，在猪蛔虫雌虫和雄虫中均有表达，但在雌虫中的表达量显著高于雄虫，可以用于制备蛔虫疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寄生虫学和生物
，具体涉及一种猪蛔虫性别表达差异的miRNA、相应的前体、反义寡核苷酸及其应用。
技术介绍
猪蛔虫(Ascaris suum)是猪体内最常见的寄生虫之一。猪蛔虫病流行广泛，是危害广、造成严重经济损失、呈全球性分布的一大类寄生虫，对养殖业危害尤为严重。虽然猪蛔虫感染通常并不致命，但由此导致的饲养猪营养不良及幼龄猪发育不良给农业和畜牧业造成巨大经济损失。而长期过度的使用抗蠕虫药物已造成呈全球性分布的寄生虫抗药性问题以及动物产品及环境中的药物残留问题。因此，加快对猪蛔虫的研究、寻找有效防治猪蛔虫的新途径已经迫在眉睫。miRNA是一类内源性的非编码小RNA，广泛存在于真核生物中，具有发育阶段的特异性、时序性或者组织特异性的表达特点，其功能主要为从转录后调控的水平调节个体生长及发育相关基因表达。研究业已表明，寄生线虫存在独特的miRNA转录后调控机制，它们可以通过miRNA实现对宿主和自身基因表达模式的精确调控，从而提高感染和自身增殖的几率并逃避免疫监视。通过选择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育，从而减少或阻断寄生线虫的传播很可能是防治线虫感染的新思路、新途径。猪蛔虫物种特异性miRNA有可能成为猪蛔虫免疫预防或化学防治的新的“关键”分子，为核酸疫苗制备提供基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性问题，以及动物产品和环境中的药物残留问题，提供一种猪蛔虫性别表达差异的miRNA、相应的前体、反义寡核苷酸。本专利技术另一目的在于提供上述猪蛔虫性别表达差异的miRNA、相应的前体、反义寡核苷酸的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：一种猪蛔虫性别表达差异的miRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1～3所示的任意一条序列，其中，SEQ ID NO：1所示序列为miR-1，SEQ ID NO：2所示序列为miR-2，SEQ ID NO：3所示序列为miR-3。与所述猪蛔虫性别表达差异的miRNA相应的前体，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4～6所示。与所述猪蛔虫性别表达差异的miRNA相应的反义寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。其中，所述反义寡核苷酸为DNA或RNA。-->作为一种优选方案，所述反义寡核苷酸为经过修饰的反义寡核苷酸，如硫代修饰或甲氧基修饰。本专利技术所提供的猪蛔虫性别表达差异的miRNA前体基因在马来布鲁线虫(brugia malayi)染色体上的定位分别是，miR-1前体基因定位于gi|154235311|gb|AAQA01000505.1|：22866：22942：+77(nt)；miR-2前体基因定位于gi|154235343|gb|AAQA01000473.1|：4581：4661：-81(nt)；miR-3前体基因定位于gi|154235359|gb|AAQA01000457.1|：25285：25373：-89(nt)。据此，本专利技术所提供的三种新型miRNA均克隆自猪蛔虫成虫，成熟的miRNA序列长度为20～23nt，其前体序列均可形成miRNA前体的典型二级结构，符合miRNA的结构特征。荧光实时定量PCR检测结果表明，三种新型miRNA在猪蛔虫雌虫和雄虫中均有表达，但是在雌虫中表达量明显高于雄虫，在雌虫中miRNA-1的相对表达量为雄虫的2.7倍；在雌虫中miRNA-2的相对表达量为雄虫的33.7倍；在雌虫中miRNA-1的相对表达量为雄虫的2.69倍；说明三种新型miRNA分子在猪蛔虫中具有重要的生物学功能，并且其功能与猪蛔虫性别密切相关。因此，在猪蛔虫体内过表达miR-1～miR-3前体分子或采用miRNA反义寡核苷酸抑制miR-1～miR-3的表达将影响猪蛔虫生理功能及与性别发育或性别分化相关的功能。此外，鉴于猪蛔虫和人蛔虫的物种相似性，本专利技术所提供的三种新型miRNA前体及其反义寡核苷酸亦可应用于影响人蛔虫生理功能及与性别发育或性别分化相关的功能。因此，本专利技术所述的miRNA、相应的前体或反义寡核苷酸可以用于制备蛔虫疫苗，特别是猪蛔虫疫苗或人蛔虫疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术猪蛔虫性别表达差异的miRNA均克隆自猪蛔虫成虫，在猪蛔虫雌虫和雄虫中均有表达，但在雌虫中的表达量显著高于雄虫，可以用于制备蛔虫疫苗，在猪蛔虫中具有重要的生物学功能，并且其功能与猪蛔虫性别密切相关，因此可以用于影响人蛔虫生理功能或与性别发育、分化相关的功能。附图说明图1为荧光定量PCR检测猪蛔虫miRNA在不同性别中的表达情况。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例1miRNA的获得1.总RNA抽提1)猪蛔虫成虫整体称重，用液氮研磨组织至粉末，加入100mg/mL加入Trizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；2)取裂解液1ml加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；3)4℃下，10,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；-->4)沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；5)4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；6)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；7)加入15～60μl DEPC水溶解沉淀。2.总RNA纯度和完整性检测1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8。2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整。3.small RNA序列的获得和筛选用15％PAGE胶回收20-30nt的small RNA，加上5′和3′接头(购自Illumina公司)后实施RT-PCR(反转录试剂盒购自Invitrogen公司)。产物经6％TBE PAGE胶纯化后进行Solexa测序。然后屏蔽掉可能为接头序列的部分、测序质量差的序列(例如测序信号很低等)及长度小于18nt的序列获得cleanreads。4.miRNA的鉴定用BLAST程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)将clean reads与GenBank和Rfam database(version 9.0)(http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/mirna)进行比对分析，去除非编码RNA序列，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，和other ncRNA；通过RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org)去除转座子等重复序列；然后搜索Sanger miRBase(version 13.0)数据库去除保守性miRNA；clean reads用Short Oligo nucleotideAnalysis Package(SOA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪蛔虫性别表达差异的ｍｉＲＮＡ，其核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３所示的任意一条序列。
【技术特征摘要】
1.一种猪蛔虫性别表达差异的miRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1～3所示的任意一条序列。2.权利要求1所述猪蛔虫性别表达差异的miRNA相应的前体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～6所示。3.权利要求1所述猪蛔虫性别表达差异的miRNA相应的反义寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。4.根据权利要求3所述的猪蛔虫性别表达差异的miRNA相应的反义寡核苷酸，其特征在于所述反义寡核苷酸为DNA或RNA。5.根据权利要求4所述的猪蛔...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐民俊，袁子国，宋慧群，林瑞庆，朱兴全，贺现辉，刘春艳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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