一种蚯蚓抗菌肽的制取方法技术

本发明专利技术公开了一种蚯蚓抗菌肽的制取方法，属生物技术领域。技术方案包括：通过将蚯蚓体自身水解酶分解成的蚯蚓提取液离心分离，入沸水浴，超滤等步骤得到蚯蚓抗菌肽粗提液；然后将粗提液通过分子筛柱层析、离子交换柱层析、脱盐等步骤进行纯化而得到蚯蚓抗菌肽。本发明专利技术具有原材料（蚯蚓）来源广泛、制取方法简单，产品纯度高等优点。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
随着生物化学的迅猛发展，尤其是遗传学和分子生物学的出现，昆虫学和昆虫免疫学的研究进入了新的时期，20世纪80年代发现了抗菌肽，抗菌肽对细菌杀伤作用很强，除了广谱抗菌作用外，已证实抗菌肽对真菌、原虫也有杀伤和抑制作用，其神奇作用还包括其对病毒和肿瘤细胞的作用。由于抗菌肽具有很高的应用价值，所以，国内外许多学者和研究者都在努力探索抗菌肽的获得方法。蚯蚓来源广泛，但到目前为止，我们尚未见到有关蚯蚓抗菌肽的系统高效分离提纯方法的研究报道。本专利技术的目的在于提供一种操作简单，纯度高的蚯蚓抗菌肽的制取方法。为了达到本专利技术的目的所采取的技术方案包括下列步骤1)蚯蚓抗菌肽粗提液的制备将活蚯蚓用水洗净，并浸泡清肠，把洗净的蚯蚓沥干、绞碎后加入1/5-1/4体积乙酸或磷酸溶液，在35-45℃温度下，蚯蚓体被自身水解酶分解成蚯蚓提取液；将蚯蚓液离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，入沸水浴，边加热边搅动5-15分钟，然后离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，用能通过分子量10000Da规格的超滤系统过滤或高速离心机分离得蚯蚓抗菌肽粗提液；2)蚯蚓抗菌肽的分离纯化(1)分子筛柱层析添料Sephadex G-25；上样蚯蚓抗菌肽粗提液；洗脱液0.033M乙酸，pH3-3.5；UV254nm检测，按吸收峰收集；将收集的溶液进行低温真空干燥得蚯蚓抗菌肽的活性峰干粉；(2)离子交换柱层析添料DEAE纤维素DE52；平衡液0.005MTris-HCl，pH7-8.5；梯度洗脱；上样SephadexG-25柱层析，将冷冻干燥的蚯蚓抗菌肽活性峰干粉，加平衡液及乙醇溶解后上样；(3)脱盐添料Sephadex G-10’；洗脱液0.033M乙酸，pH3-3.5；检测波长254nm；上样离子交换柱层析的活性峰干粉加洗脱液溶解。上述的方法在实际操作中可以是(1)在蚯蚓抗菌肽粗提液的制备过程中，蚯蚓沥干、绞碎、加入乙酸或磷酸溶液后，在36-38℃温度下，蚯蚓体被自身水解酶分解成蚯蚓提取液；在沸水浴中的加热时间为8-10分钟；(2)分子筛柱层析添料Sephadex G-25；流速3.5ml/Tub./10min；柱体积2.5×90cm；上样蚯蚓抗菌肽粗提液；洗脱液0.033M乙酸，pH3.2；UV254nm检测，按吸收峰收集；将收集的溶液置于干燥瓶中，在-40℃乙醇中旋转，使液体均匀地在瓶壁上结冰；取出干燥瓶在冷冻干燥机上低温真空干燥得蚯蚓抗菌肽的活性峰干粉；(3)离子交换柱层析添料DEAE纤维素DE52；平衡流速2ml/Tub/10min；柱体积2.2×16cm；平衡体积100ml；平衡液0.005MTris-HCl，pH8.0；洗脱流速4ml/Tub/10min，梯度洗脱；上样Sephadex G-25柱层析，将冷冻干燥的活性峰干粉，加平衡液及乙醇溶解后上样；(4)脱盐添料SephadexG-10’；流速3ml/Tub/10min；柱体积1.5×38cm；洗脱体积200ml；洗脱液0.033M乙酸，pH3.2；检测波长254nm；上样离子交换柱层析的活性峰干粉加洗脱液溶解。本专利技术具有原材料(蚯蚓)来源广泛、制取方法简单，产品纯度高等优点。下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。1)蚯蚓抗菌肽粗提液的制备取2500克活蚯蚓用水洗净，浸泡4-6小时清肠，把洗净的蚯蚓沥干，用绞碎机绞碎后加入1/5-1/4体积乙酸或磷酸溶液，在36-38℃温度下，制备成蚯蚓提取液2000毫升；10000转/分离心10分钟，取上清液，用乙酸缓冲液按体积稀释1倍，在沸水浴中加热8-10分钟，边加热边搅动，处理后，再离心10分钟，取上清液，按体积稀释1倍后，用能通过分子量10000Da规格的超滤系统(Millipore公司产品)过滤得蚯蚓抗菌肽粗提液；根据此种抗菌肽耐高温处理的特点，以沸水浴热加热处理前后蛋白质含量(用Folin-酚法测定)变化为，蚯蚓提取液和加热后上清液蛋白浓度分别为185mg/ml和6.2mg/ml。加热处理后上清液蛋白占提取液总蛋白的3.35％，即96.65％蛋白质变性去掉。经超滤分离之后，又滤去部分分子较大的蛋白和多肽，滤过液蛋白质含量为5.34％。2)分子筛柱层析添料Sephadex G-25；流速3.5ml/Tub./10min；柱体积2.5×90cm；上样取蚯蚓液抗菌肽粗提液20ml(淡红色透明液pH5.5)；洗脱液0.033M乙酸，pH3.2；洗脱体积60ml；UV254nm检测，按吸收峰收集；将收集的溶液置于干燥瓶中，在-40℃乙醇中旋转，使液体均匀地在瓶壁上结冰；取出干燥瓶在冷冻干燥机上低温真空干燥；取奇数管测254和280nm的紫外吸收绘图，得5个峰，其中峰4为活性成分，记作A3-4，有抑菌作用，A3-4经HPLC检测仍有三种成分；3)离子交换柱层析添料DEAE纤维素DE52；平衡流速2ml/Tub/10min；柱体积2.2×16cm；平衡体积100ml；平衡液0.005MTris-HCl，pH8.0；洗脱流速4ml/Tub/10min，梯度洗脱；上样Sephadex G-25柱层析，收集冷冻干燥的活性峰干粉，加平衡液3ml及1-2ml乙醇溶解后上样；A3-4经冰冻干燥得23mg白色干粉。称15mg溶解后，上DEAE纤维素DE52经梯度洗脱，紫外检测有两个峰4-1和4-2，其中峰4-2是活性成分，有抑菌作用。记作A3-4-2；4)脱盐添料Sephadex G-10；流速3ml/Tub/10min；柱体积1.5×38cm；洗脱体积200ml；洗脱液0.033M乙酸，pH3.2；检测波长254nm；上样离子交换柱层析的活性峰干粉加洗脱液3ml溶解。A3-4-2经冰冻干燥得白粉末，用氯离子检测含盐，用SephadexG-10脱盐，氯离子检测结果27-33管是A3-4-2，经检测不含氯。冷冻干燥得0.8mg淡黄色粉末。实际操作时，上述第二步中剩余的1800ml的蚯蚓液抗菌肽粗提液可按照第二到第四的相应步骤得到蚯蚓液抗菌肽的纯品。因此，2500克鲜活蚯蚓可得纯蚯蚓抗菌肽(A3-4-2)123毫克.按干物质重折算得率为万分之3.13(0.123克/392.5克)，收获率较高。纯度检测方法高压液相色谱分析反相制备柱，洗脱液B95％乙醇，C重蒸水；按50％B液经30分钟到100％；B液梯度洗脱，最大压强300ATM，最小压强为0；温度40℃，流速0.5ml/min，紫外检测波长254nm。上实施例用HPLC检测A3-4-2纯度A3-4在HPLC上有3个峰，A3-4-2有2个峰。同样条件，以0.1ml 0.01M Tris作对照，出现一小峰，其保留时间及峰型与A3-4-2中的II相同，说明峰II是样品中残留的Tris，由此认为A3-4-2已被纯化。蚯蚓抗菌肽的抗菌活性测定1、抑菌活力测定采用改进的抑菌圈法，具体步骤为(1)菌种活化取冰箱保存的菌种接入斜面培养基，37℃恒温培养24h；(2)细菌悬液制备取活化好的大肠杆菌于1ml无菌水中，制成细菌悬液；(3)取0.3ml菌悬液，细菌浓度2×100000细菌/ml，加入直径为9cm的培养皿中；加熔化的蛋白栋培养基14ml，凝固后，用灭菌滤片(直径6mm)蘸样品溶液，置于培养基上，37℃恒温培养1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蚯蚓抗菌肽的制取方法包括下列步骤：１）蚯蚓抗菌肽粗提液的制备将活蚯蚓用水洗净，并浸泡清肠，把洗净的蚯蚓沥干、绞碎后加入１／５－１／４体积乙酸或磷酸溶液，在３５－４５℃温度下，蚯蚓体被自身水解酶分解成蚯蚓提取液；将蚯蚓液离心分离， 取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，入沸水浴，边加热边搅动５－１５分钟，然后离心分离，取上清液，用乙酸缓冲液稀释后，用能通过分子量１００００Ｄａ规格的超滤系统过滤或高速离心机分离得蚯蚓抗菌肽粗提液；２）蚯蚓抗菌肽的分离纯化（１）分子筛柱层 析添料：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５；上样：蚯蚓抗菌肽粗提液；洗脱液：０．０３３Ｍ乙酸，ｐＨ３－３．５；ＵＶ２５４ｎｍ检测，按吸收峰收集；将收集的溶液进行低温真空干燥得蚯蚓抗菌肽的活性峰干粉；（２）离子交换柱层析添料：ＤＥＡＥ纤维 素ＤＥ５２；平衡液：０．００５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７－８．５；梯度洗脱；上样：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析，将冷冻干燥的蚯蚓抗菌肽活性峰干粉，加平衡液及乙醇溶解后上样；（３）脱盐添料：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１０’；洗脱液：０ ．０３３Ｍ乙酸，ｐＨ３－３．５；检测波长：２５４ｎｍ；上样：离子交换柱层析的活性峰干粉加洗脱液溶解。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振钧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]