用于基因疗法和转移的预防以及肿瘤的基因疗法的药剂制造技术

本发明专利技术涉及用于原发性肿瘤和转移的预防和治疗的药剂。其主要内容关系到基因疗法的载体以及具有增强子／启动子成分和转基因的ＤＮＡ顺序。药剂的个别成分的选择是要保证它们孕育在有可能或已经遭受侵袭的器官的正常组织，以抵卸入侵的肿瘤细胞。这样就能防止转移部位的产生，诱发现有部位的萎缩或限制原发性肿瘤的侵犯。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】恶性肿瘤疾患最常见的死因是器官转移。而在原发性肿瘤的早期或中期阶段，至少是能够用外科切除的，但在转移的情况下，这种切除的可能性就很小了。除少数例外不计，常规的化疗和放射疗法是有效的，虽然不是根治，不过那也只是达到转移肿瘤临床图像的一时性改善而已。结肠直肠癌属于常见的肿瘤。而源于结肠直肠的肝转移，则是结肠直肠癌患者经常发生的死因。由于原发性肿瘤在外科切除后往往经过较长时间才出现疾病的一些症状，所以它们就成为痊愈的治疗方案的可能目标(JA.德莱本和JE.尼德胡伯下部胃肠道的癌症——结肠癌，载于JE.尼德胡伯编“现代肿瘤疗法”。M.O.圣·路易防护剂，426-431)。然而，肝转移有可能治愈的外科切除仅有很小的百分率的病人是可能的，而且对化疗来说，虽然暂时显示减轻，可是仍不能延长寿命。因此，迫切需要的是改革治疗方式。研制十几年的现行基因疗法方案，根据其错综复杂性，是一种具有反传统的疗法形式，它显著地提高了可调整的范围。这个方案是能够在癌症基因疗法的领域内应用的，尤其是对于肿瘤有特异性的载体靶向或限制肿瘤组织的基因表达，而且特别适应转移的转基因的各种类型肿瘤的薄弱的环节。除了免疫学最新知识以外，迄追求的基因疗法方案，正如已经采用的常规方法一样，几乎只将侵润的肿瘤组织作为主攻对象。这里隐藏着一些肿瘤所不能彻底解决的疑难问题，它表现在瘤内压增高，血液供应受限，甚至还有人用一般方式将基因疗法的转移工具直接注射到瘤内，没有击中要害。在多种转移的情况下，有人指出，当时系统或部位所需的载体药量，甚至使周边的正常组织比肿瘤细胞还容易受到感染。本专利技术旨在改善肿瘤转移和原发性肿瘤的预防和治疗。本专利技术是按照要求而实现的。按照本专利技术所研究出来的策略，是围绕着肿瘤组织不易解决的难点，揭示以极易达到正常组织为主的靶向基因疗法。该法的特征在于使正常器官组织直接在有可能转移或已经发生转移的部位具有防御能力，这种能力就是防止转移发生和继续生长。同时也能防止未作手术的原发性肿瘤的继续扩展。这种孕育健康组织的策略大大不同于目前所采用的各种基因疗法和非基因疗法的方案。与系统的或腹膜内用合成蛋白酶抑制剂之类的药物相比(N.J.奈尔逊血管生成的抑制剂已进入三期试验，自然癌症研究所杂志，90，960-963)，基因疗法的配方是有其优点的，那就是它使局部靶器官中的有效物质达到极高的浓度，还有一些优点如副作用减少和可用多种抑制剂(见下文)。此外，就持续的基团表达而言，应用一次载体比长期反复服用合成的物质的费用要合算得多，副作用也少。以下临床记录是同上述方案相吻合的。1.手术前或手术中在靶器官内应用载体，可以防止原发性肿瘤在手术时有转移的肿瘤细胞脱落外渗。2.在靶组织内，连续几年出现的抑制剂辅药可以防止隐蔽的微转移物的生长，而且杀死它们，这主要用在高危组，如有淋巴结侵袭的需作手术的乳腺癌。3.限制已经发生转移的或未作手术的原发性肿瘤的生长。实例1结肠直肠的肝转移通过金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的腺病毒传送到肝实质的基因疗法。结肠直肠癌在转移时产生各种不同的蛋白酶(Protease)。这些蛋白酶是为了内渗和外渗以及侵犯靶组织的需要。其中有各种金属蛋白酶(MMPS)尤其是金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白酶-9(MMP-9)，它们是管细胞外间质物质(ECM)成分的降解的(M.J.杜飞和K.麦克卡赛癌症的金属蛋白酶间质治疗的预后标记的靶向，国际肿瘤学杂志，12，1343-48)。被金属蛋白酶-2和-9首先裂解的是作为基底膜主要成分的胶原蛋白IV(Kollagen IV)。出于这种考虑，人们研制了合成的蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor)，该抑制剂在临床上已经投入使用，并且在某些情况下已达到临床试验第三期(N.J.奈尔逊血管生成的抑制剂已进入三期试验，自然癌症研究所杂志，90，960-963)。按照本专利技术所研制的疗法的基本思路，是使金属蛋白酶的抑制物质对肝的实质进行封锁，以便抑制转移的肿瘤细胞外渗，防止外渗继续侵入已经发生转移的肿瘤，而对有血管供应的肿瘤，则利用抑制血管发育而将其结扎。首选的是金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-2)，正如所用的许多物质一样，这种抑制剂也是以生理学方式负责限制金属蛋白酶在改组过程中的活力的。由于它连接在金属蛋白酶-2上，所以金属蛋白酶组织抑制剂-2可以抑制其活性。建立试验的基团转移系统的第一代腺病毒(Erstgenerations-Adencviren)是用来作基因转移载体的(K.勃兰德和M.斯特劳斯基因转移的分子基础和基因疗法的应用，载于D.鲁克保尔和D.甘顿分子医学手册，第2卷，肿瘤疾患，斯普灵格，柏林，海德堡，纽约)。这些载体不能因缺少腺病毒E1-基因而进行复制，它们高效地感染上皮细胞，并可在必要时大量地基因化。a)为了证明体外肝细胞分泌金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)，可用不同的传染重复性(MOIs)和Ad-TIMP-2感染A2细胞(来自P53K.O.小鼠的肝细胞的细胞系)。Ad-TIMP-2的结构已有人描述过(A.H.贝克尔，G.W.威尔金逊，R.M.亨伯利，G.姆尔菲和A.C.纽贝带动高水平人体金属蛋白酶-9的表现和金属蛋白酶-1和-2基因的组织抑制剂的重组腺病毒的发育其在兔子平滑肌细胞中和在人类MCF-7腺癌细胞中的传染特点。间质生物学15383-395)。在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下，该病毒含有人类的TIMP-2互补DNA(cDNA)。经过24小时或48小时后，达到细胞培养突出点(ZKU)。将10μl涂在10％的聚丙烯酰胺凝胶上，经过电泳分离后再转移到硝化纤维膜上。要作免疫学证明，可应用单克隆抗体(T2-101，图1，迪阿诺瓦，汉堡，德国)。西方文献指出，在Ad-TIMP-2感染细胞的突出点上有一个很强的TIMP-2带，而在未感染病毒的和感染对照病毒的突出点上则无此带。b)金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)的功能是利用反向酶谱来检验的(A.H.贝克尔，G.W.威尔金逊，R.M.亨伯利，G.姆尔菲和A.C.纽贝带动高水平人体金属蛋白酶-9的表达和金属蛋白酶-1和-2基因的组织抑制剂的重组腺病毒的发育其在兔子平滑肌细胞中和在人类MCF-7腺癌细胞中的传染特点。间质生物学15383-395)。如a)所述，细胞受到感染。细胞培养突出点(ZKU)利用一个Amicon浓度计(Lexington，MA.U.S.A.)进行浓缩。加入NaN3、Brij氏去污剂和CaCl2，以获得0.1％、0.05％及5mM的最终浓度。样品用不还原的缓冲液混合，置于10％的聚丙烯酰胺凝胶上，该凝胶含有1mg/ml的白明胶(猪皮I型，bloom300，SIFMA G2500)和107ng/ml的活性金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白质(肿瘤发生，Cambridge，MA.U.S.A)。电泳后，将十二烷基磺酸钠(SDS)通过酝酿2小时在2.5％的三硝基甲苯(Triton x100)中与凝胶分离。凝胶过夜在50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(Tris HCl)，pH8.0，50mM NaCl，10nM CaCl2，0.05％Brij氏去污剂-35和0.02％NaN3中在温度37℃下酝酿成熟。凝胶用0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于肿瘤疾患的基因疗法的预防和治疗的药剂，其中包括：－就基因转移工具的意义而言的载体，－增强子／启动子，－转基因，对此至少有所提出的一种成分传至正常组织中孕育。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K布朗特，A巴克，M斯特劳斯，
申请(专利权)人：K布朗特，
类型：发明
国别省市：DE[德国]