双歧杆菌细胞壁蛋白在制药中的应用制造技术

本发明专利技术通过实验证明了双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白对防御素基因是有效的活化因子，能使防御素的表达明显增高，因此，可将双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白用于制备激活哺乳动物防御素基因的药品，用药方法可以通过口服、静脉内的注射、吸入或者栓剂、灌肠、或者口腔冲洗。根据人体中防御素的特点，此类药物主要用于消化道、呼吸道、泌尿生殖道等感染性疾病的免疫治疗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白的用途，特别涉及在制药领域中的用途。
技术介绍
双歧杆菌是发现最早的生理性细菌之一，现已在肠道疾病的防治、肝病的治疗等方面获得了临床应用(见《双歧杆菌》P131-139，康白主编，大连海事大学出版社，1998年5月)。研究表明，其对机体免疫系统有着重要的影响，尤其是可激活机体免疫系统，例如，激活巨噬细胞、B淋巴细胞、NK细胞、……(见“双歧杆菌的免疫激活作用及其生物学意义”，王立生综述，潘令嘉周殿元审校，国外医学生理、病理科学与临床分册，1998.18(4)，P320-322)，但尚未见关于双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白激活防御素(defensins)方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于证明双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白具有激活防御素基因表达的作用，以便开发出一类新的药品。防御素是一类富含半胱氨酸和精氨酸的低分子多肽，广泛分布于动物、植物和昆虫体内。与其他抗微生物肽相比，防御素具有特殊的抗性机理，它主要作用于病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性。而其他抗微生物肽主要作用于微生物的酶，酶基因的突变就会使靶细胞对其产生抗性，因此防御素具有其他抗微生物肽无可比拟的优势。此外防御素还具有十分广泛的抗菌谱，体外抑菌实验表明防御素可以抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物，尤其是哺乳动物防御素除了对细菌、真菌、被膜病毒有毒杀作用外，还对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞(如肿瘤细胞)和爱滋病毒有杀伤作用，具有更为广泛的抗菌谱。除了直接杀伤病原微生物外，对天然免疫和获得性免疫系统的功能还有刺激作用，因此在医药上有着更广泛的应用前景和更高的应用价值，但从宿主有机体中分离防御素成本极高，使得防御素的利用受到限制(见“哺乳动物防御素的研究进展及其应用前景”陈颖、葛毅强等，生物化学与生物物理进展，2001；28(1)，P17-21)。新近的研究显示，防御素(内源性抗菌肽)具有诱导表达的特点，感染、创伤和炎症信号可刺激皮肤和粘膜上皮细胞合成和分泌内源性抗菌肽(见DiamandG，Bevins CL.β-defensinsEndogenous antilcuotics of the innate host defense response.Clin Immunol Immunopathol，1998，88221-225)，卡菌苗胞壁蛋白能增强人肺腺上皮细胞防御素hBD-1mRNA的表达及其抗菌活性(见“卡菌苗胞壁蛋白诱导人肺腺上皮细胞hBD-1mRNA表达及其抗菌活性的增强”，冯云等，中华微生物学和免疫学杂志2001年7月第21卷第4期，P400-403)。可见，通过活化因子刺激防御素表达是利用防御素的一条更现实的途径。本专利技术通过实验证明了双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白对防御素基因是有效的活化因子，能使防御素的表达明显增高。所激活的哺乳动物防御素为β-防御素-1、β-防御素-2、β-防御素-3、β-防御素-4、LL-37/CAP18。因此，可将双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白制备成激活哺乳动物防御素基因的药品，用药方法可以通过口服、静脉内的注射、吸入或者栓剂、灌肠、或者口腔冲洗。根据人体中防御素的特点，此类药物主要用于消化道、呼吸道、泌尿生殖道等感染性疾病的免疫治疗。本专利技术中的双歧杆菌细胞壁和细胞壁蛋白的制备方法如下1、双歧杆菌细胞壁的制备将冻干的双歧杆菌溶于裂解液(0.02mol/L磷酸缓冲液pH7.4，0.025％PMSF)中，冰浴下，20,000赫兹超声间断处理10～15次，每次处理时间为2分钟，每次间隔时间为1～3分钟，2000×g离心5分钟，取上清，然后55,000×g离心30分钟，取沉淀，溶于0.02mol/L的磷酸缓冲液中，获得细胞壁组分。2、双歧杆菌细胞壁蛋白的制备将双歧杆菌细胞壁溶于含1～2％SDS的磷酸缓冲液，室温下孵育30～45分钟，55,000～75,000×g离心30～45分钟，取上清，透析3天，按沉淀法的操作程序除去SDS，然后在-70℃冷冻、在-112℃经冻干机冻干浓缩，冷冻干燥后的双歧杆菌细胞壁蛋白的保存温度为-20℃。本专利技术具有以下优点和积极效果1、双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白制备的药品通过激活机体内的防御素基因达到防治疾病的目的，开辟了一种新的免疫疗法。2、防御素可在哺乳动物的很多组织表达，例如大脑、肾脏、心脏、脾、颊黏膜、鼻黏膜、眼结膜、舌脉络丛、气管、支气管、洗支气管、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、膀胱、尿道、食管、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、升结肠、乙壮结肠、盲肠、降结肠和直肠、耳朵、胰腺、肝脏、卵巢等，因而双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白制备的药品可用来治疗哺乳动物包括人类和动物多个组织所患的疾病。3、双歧杆菌对于宿主有益，它们之间处于共生状态，因而双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白制备的药品在诱导防御素的表达时只杀死包括病原体在内的敏感的非益生菌，而对于益生菌没有直接效应，并可使益生菌获得更多的营养，这对于益生菌在体内微生态环境提供很有效生长优势。4、双歧杆菌的来源广，双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白的制备方法简单，便于实现工业化生产。四附图说明图1是双歧杆菌细胞壁蛋白的检测图，图中，A为除去SDS前的双歧杆菌细胞壁蛋白，B为除去SDS后的双歧杆菌细胞壁蛋白，M为蛋白质分子标记；图2是各实验组的人肠腺上皮细胞HT-29的总RNA检测图；图3是利用RT-PCR检测双歧杆菌、双歧杆菌细胞壁、双歧杆菌细胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞人β-防御素-1(hBD-1)基因表达的实验结果图，图中，A为HT-29细胞本身hBD-1mRNA有低量的基础表达，B为双歧杆菌刺激后hBD-1mRNA的表达，C为双歧杆菌细胞壁刺激后hBD-1mRNA的表达，D为双歧杆菌细胞壁蛋白刺激后hBD-1mRNA的表达，M为DNA分子量标记；图4是利用Northern技术检测双歧杆菌、双歧杆菌细胞壁、双歧杆菌细胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞人β-防御素-1(hBD-1)mRNA表达的实验结果图，图中，A为阴性对照HT-29细胞总RNA，B为双歧杆菌刺激后的HT-29细胞总RNA，C为双歧杆菌细胞壁刺激后的HT-29细胞总RNA，D为双歧杆菌细胞壁蛋白刺激后的HT-29细胞总RNA； 图5是利用RT-PCR检测双歧杆菌、双歧杆菌细胞壁、双歧杆菌细胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞人β-防御素-2(hBD-2)基因表达的实验结果图，图中，A为阴性对照hBD-2mRNA的表达，B为双歧杆菌刺激后hBD-2mRNA的表达，C为双歧杆菌细胞壁刺激后hBD-2mRNA的表达，D为双歧杆菌细胞壁蛋白刺激后hBD-2mRNA的表达，E为阳性对照IL-1β刺激组诱导hBD-2mRNA的表达；图6是是利用Northern技术检测双歧杆菌、双歧杆菌细胞壁、双歧杆菌细胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞人β-防御素-2(hBD-2)mRNA的实验结果图，图中，A为阴性对照HT-29细胞总RNA，B为双歧杆菌刺激后的HT-29细胞总RNA，C为双歧杆菌细胞壁刺激后的HT-29细胞总RNA，D为双歧杆菌细胞壁蛋白刺激后的HT-29细胞总RNA，E为阳性对照IL-1β后的HT-29细胞总RNA；图7本文档来自技高网...

【技术保护点】
双歧杆菌细胞壁和双歧杆菌细胞壁蛋白在制备激活哺乳动物防御素基因的药品中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王伯瑶，王国兴，黄宁，吴琦，汪宇辉，冯云，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]