本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种拟南芥色素调控蛋白基因的克隆、原核表达与蛋白纯化，拟南芥花青素ｐａｐ１纯化蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从拟南芥紫红色叶片中克隆ｐａｐ１全长ｃＤＮＡ，然后再利用原核表达系统将该基因在大肠杆菌ＢＬ２１中进行表达，然后采用镍柱法纯化，获得拟南芥ＰＡＰ１的纯化蛋白。拟南芥花青素ｐａｐ１纯化蛋白在制备Ｍｙｂ抗体中的应用和拟南芥花青素ｐａｐ１纯化蛋白在Ｍｙｂ蛋白表达检测中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种拟南芥色素调控蛋白基因的克隆、原核 表达与蛋白纯化，拟南芥花青素papl纯化蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
花色苷是广泛分布于植物中的次生代谢物，它是来源于苯丙氨酸的一类类黄酮， 它是水溶性的，在细胞质中合成，最终定位到液泡；它提供了从橘色/红色到紫色/蓝色一 系列的颜色。另外花色苷可能对于氧化胁迫所导致大脑皮层的紊乱有治疗作用，还可以提 高由于卵巢切除而导致雌激素缺乏的小鼠的学习和记忆能力。近年来许多研究表明花色苷 具有包括抗氧化、抗炎症、抗菌、抗癌和降低冠心病的发病率一系列的生理活性。部分myb 类转录因子在转录水平上调节花色苷的生物合成，拟南芥Pap基因就属于调节花色苷生物 合成的myb类基因。到目前为止，所有的高等植物的花色苷途径都是由包括Myb、bHLH和 WD40的一套转录因子调控的；与其它植物不同，在拟南芥中PAPl (Myb)/bHLH/WD40复合物 能够作用于整个苯基丙酸类合成途径；但是，拟南芥的Myb类调节因子还未完全鉴定清楚， 并且对TTGl-依赖型转录复合物调节的花色苷途径还知之甚少。papl在转录水平上调节花 色苷的生物合成，因此许多学者对papl进行了大量研究，包括基因的克隆、papl转拟南芥、 番茄、烟草愈伤组织等，但是现有技术尚没有对于AtPAPl蛋白的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得纯化PAPl蛋白，用于制作PAPl多克隆抗体。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案拟南芥花青素papl纯化蛋白，由下述方法制备而得(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1. 3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘( 5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATC AAATTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的 原核表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥 紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进 行扩增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒， 通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行 双酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h， 获得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在 IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。拟南芥花青素papl纯化蛋白的制备方法，包括下述步骤(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1. 3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘( 5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATC AAATTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的 原核表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥 紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进 行扩增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒， 通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行 双酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h， 获得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在 IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。拟南芥花青素papl纯化蛋白在制备Myb抗体中的应用。拟南芥花青素papl纯化蛋白在Myb蛋白表达检测中的应用。本专利技术利用RT-PCR技术从拟南芥紫红色叶片中克隆papl全长cDNA，然后再利 用原核表达系统将该基因在大肠杆菌BL21中进行表达，然后采用镍柱法纯化，获得拟南芥 PAPl的纯化蛋白。本专利技术papl基因的克隆、原核表达和纯化根据NCBI已报道序列(NM_104M1.3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘ (5CC ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATCAAA TTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核 表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点。以拟南芥紫红 色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶(Promega公司)合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和 PAP1-T3'进行扩增。回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体(宝生物工程有限公司，Takara) 上，采用碱裂解法提取质粒，通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl。构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行双酶切分别获得papl 基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获得原核表达载体pET32已一papl0PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在IPTG诱导下摸索最佳表 达条件，在最适条件下进行大量表达。PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。附图说明图1 为总 RNA ；图2为pap 1基因的扩增；图3为papl的大量扩增；图4为papl胶回收；图5为papl菌液的PCR检测；图6为NcoI禾口 XhoI双酶切；图 7 为 pET32a_papl 质粒；图 8 为 3h_paplPCR 检测；图9为NcoI和XhoI双酶切检测；图 10 中 M :protein marker-0431 ；1 对照，IPTG 未诱导的总蛋白；2、3、4、5 =ImM IPTG分别诱导2、4、6、8h的总蛋白；图11为原核表达载体pET3h_papl的构建。具体实施例方式下面结合附图，用本专利技术的实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此 来限定本专利技术。实施例1 试剂与仪器试剂主要为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．拟南芥花青素ｐａｐ１纯化蛋白，由下述方法制备而得：（１）根据ＮＣＢＩ已报道序列（ＮＭ＿１０４５４１．３）的完整阅读框架，设计引物ＰＡＰ１－Ｔ５′（５ＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧＧ３′，划线处为酶切位点ＮｃｏＩ）和ＰＡＰ１－Ｔ３′（５′ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣ３′，划线处为酶切位点ＸｈｏＩ）进行ｃＤＮＡ全长扩增，为方便后续的原核表达研究，分别在ＰＡＰ１－Ｔ５′和ＰＡＰ１－Ｔ３′的５′端引入ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ位点；以拟南芥紫红色叶片总ＲＮＡ为模板，用Ｍ－ＭＬＶ反转录酶合成ｃＤＮＡ后使用ＰＡＰ１－Ｔ５′和ＰＡＰ１－Ｔ３′进行扩增；（２）回收ｐａｐ１全长片段，并将其连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，采用碱裂解法提取质粒，通过酶切检测获得重组质粒ｐＭＤ１８－ｐａｐ１；（３）构建原核表达载体：使用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对质粒ｐＭＤ１８－ｐａｐ１和ｐＥＴ３２ａ－ｘｙｋ进行双酶切分别获得ｐａｐ１基因和ｐＥＴ３２ａ载体，跑电泳后分别进行回收，然后在１６℃连接１６ｈ，获得原核表达载体ｐＥＴ３２ａ－ｐａｐ１；（４）ＰＡＰ１蛋白原核表达：使用热刺激法将ｐＥＴ３２ａ－ｐａｐ１转入大肠杆菌ＢＬ２１中，在ＩＰＴＧ诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；（５）ＰＡＰ１蛋白纯化：收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制作Ｍｙｂ抗体和Ｍｙｂ蛋白表达检测。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，张晓东，梅岩，陈丽梅，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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