本发明专利技术公开了一种猪硫酸软骨素的提取工艺。该提取工艺包括原料的预处理、酶解、吸附脱色、蛋白盐析、醇沉结晶、真空干燥等。本发明专利技术的方法以硫酸软骨素的提取率为指标，采用单因子实验、析因实验、响应面分析实验相结合的静态优化方法，优化了提取工艺，工艺条件合理，具有良好的功效稳定性。该法优点是，只需要一步酶解反应即可把硫酸软骨素从猪软骨中提取出来，提取条件温和、生产周期短、产品色泽洁白、提取率高、纯度高、无碱提取带来的污染，有利于环保，易于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪硫酸软骨素的提取工艺，尤其涉及一种利用复合蛋白酶从猪软 骨中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
硫酸软骨素(Chondroition Sulfate, CS)是来自于动物软骨组织的一类重要的酸 性黏多糖，属于糖胺聚糖类物质，主要分布于动物的软骨、喉骨、鼻骨、牛、马中膈和气管中， 其他如腿骨、韧带、皮肤、角膜等组织中也含有。硫酸软骨素主要由D-葡萄糖醛酸和N-乙 酰-D-氨基半乳糖以β _1，3糖苷键连接形成二糖，而二糖单位之间以β_1，4糖苷键连接 形成生物大分子。根据结构中硫酸基的位置不同，可将硫酸软骨素分为A、C、D、E、K、M、L等 多种异构体。硫酸软骨素用途广泛，可用做药物，主要用在治疗头疼、偏头痛的药物中，可防治 因链霉素引起的听觉障碍及肝炎的辅助治疗，因其具有降血脂、抗凝血活性，也用于高血脂 症、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的防治。随着对其理化性质及生理功能研究的深 入，发现CS还具有抗炎、抗癌、抗HIV等活性，对神经细胞、黏膜细胞、肾细胞等具有保护作 用，且CS无明显的毒副作用。同时，硫酸软骨素在食品、化妆品中的用途也很广。目前，CS 生产工艺简单，主要用碱提取，生产周期长，提取率低，颜色较深，质量不稳定，浓碱容易使 CS发生降解，影响其生物活性，并且废料容易对环境造成污染。而酶法提取，提取率较高，纯 度也较高，生产周期较短，提取条件温和，无须脱色，无碱提取带来的污染，是比较理想的制 备方法。我国是畜牧业发达的国家，随着人民生活水平的提高，对肉、蛋、奶等传统产品的 需求数量不断增加，养殖业前景十分广阔。但是动物屠宰后，占畜禽副产品比例很大的畜骨 没有得到很好的利用。除用作动物饲料外，在食品中的应用很少。况且，与传统的畜产品加 工业相比，如肉蛋奶的加工，相去甚远。从普通畜骨创造高价值的产品，是我国畜产副产品 加工的薄弱环节，软骨是动物骨骼中的一部分，其中的蛋白多糖具有广泛的生理功能。硫酸 软骨素是单瓣多糖的组成成分之一。近年来，CS大量出口美国或欧洲，已成为出口量最大的生化医药产品之一，年出口 量约2000吨，且相当部分外贸公司因得不到质量合格产品而发愁。因此，研究新的生产工 艺及其工艺条件，使质量稳定和产率提高，进一步提高硫酸软骨素的产率和纯度，开展硫酸 软骨素在国内的应用研究和开拓市场将是很有意义的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前猪硫酸软骨素的提取工艺主要为碱提取，生产周期长， 提取率低，颜色较深，质量不稳定，浓碱容易使硫酸软骨素发生降解，影响其生物活性，并且 废料容易对环境造成污染等问题，而提供一种猪硫酸软骨素的提供工艺，缩短生产周期，提 高硫酸软骨素的提取率和纯度，降低生产成本。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下一种猪硫酸软骨素的提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)预处理将新鲜的猪软骨去油脂、肉渣，剪成长度为1 3. 5cm的小碎块；(2)酶解将处理好的猪软骨碎块放入反应釜中，其中猪软骨的质量含水量为 75% 82%，按软骨湿重料液体积比1 3 1 6 (kg/L)的比例加入蒸馏水，加入中重量 占软骨碎块湿重0. 4% -1. 2%的碱性复合蛋白酶，用碱溶液调节pH值至8. 0 9. 0，温度控 制在45 65°C之间，机械搅拌4 12小时，得酶解液；(3)吸附脱色将步骤O)中的酶解液过滤或离心除渣，得滤液或上清液，用酸溶 液将滤液或上清液调节PH值至3 7，加入吸附剂搅拌吸附1 2小时，温度控制在45 ^°C，趁热过滤得吸附滤液；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的滤液，用酸溶液调节pH值至4 6，按该滤液体积 的1 5% (kg/L)加入等重的硫酸盐，继续升温并控制温度在75 90°C，搅拌20 40分 钟，使蛋白变性沉淀，停止加热，趁热过滤得滤液；(5)醇沉结晶将步骤(4)中的滤液用酸溶液调节pH值至3 7，向滤液中加入体 积百分含量为95% 100%的乙醇，使乙醇的最终体积分数达到液体总体积的70 85%， 静置沉淀8 12小时，得沉淀物；(6)真空干燥将步骤(5)中的沉淀物，用脱水剂洗涤3 5次，于55 65°C下真 空干燥6 12小时，粉碎即得所述硫酸软骨素成品。优选步骤(1)中所述的猪软骨为猪鼻骨、喉骨、软肋、气管或月牙骨中的一种或多 种。优选步骤O)中所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，所述的碱液浓度为 1. 0 4. Omol/L O优选步骤O)中所述的复合酶是胰蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为 1 1 1 5 ；或者是微生物碱性蛋白酶与碱性内切蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 4;或者是胰蛋白酶与微生物碱性蛋白酶的复合，其质量比为1 1 1 5。优选步骤(3)中所述的吸附剂为高岭土和活性炭，高岭土和活性炭所用质量分别 占滤液体积0. 5% 3% (kg/L)和 5% (kg/L)等重。优选步骤(3)、(4)和(5)中所述的酸为盐酸或硫酸，酸溶液的浓度为2.0 6.0mol/Lo优选步骤(4)中所用硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵。步骤(5)中所用脱水剂 为无水乙醇或丙酮。有益效果(1)利用碱性复合蛋白酶提取猪硫酸软骨素，提取条件温和，生产周期短，成本低， 减少碱的用量，同时减轻下游提纯的难度，减轻了对环境的污染，易于工业化生产。(2)采用单因子实验、析因实验、响应面分析实验相结合的静态优化方法，优化提 取工艺，发现温度、酶加量和PH值对硫酸软骨素的提取率影响最为显著。(3)并以上述三因素为自变量，以硫酸软骨素的提取率为响应值，进行响应面法 分析，建立了提取条件与提取率之间的数学模型，通过响应面交互作用分析与优化，确定了 适宜的硫酸软骨素提取条件为酶解温度为45 65°C，碱性复合蛋白酶的用量为0. 4% 1. 2%，pH 值为 8. 0 9. 0。(4)在较高温度下，利用硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵进行盐析，引起蛋白质变性，能够 使酶解液中的蛋白质沉淀比较完全，提高了硫酸软骨素的纯度。具体实施例方式以下结合实例来进一步解释本专利技术，但实施案例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例1(1)预处理将新鲜的猪鼻骨去油脂、肉渣，剪成长度为2. Ocm的小碎块；(2)酶解将处理好的含水率为82%的猪鼻骨5. Okg放入反应釜中，并加入20. OL 蒸馏水，加入0.04kg的胰蛋白酶与碱性内切蛋白酶按质量比为1 1复合的复合蛋白酶， 用3. Omol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8. 5，温度控制在55°C，机械搅拌6小时，得到酶 解液；(3)吸附脱色将步骤(3)中的酶解液过滤，得滤液22. 6L，并用4. Omol/L盐酸调 节pH值至6.0，加入0. Ilkg高岭土和0. 68kg活性炭搅拌吸附1小时，温度控制在50°C，趁 热过滤得吸附滤液22. 0L；(4)蛋白盐析将步骤(3)中的22. OL吸附滤液，用4. Omol/L盐酸调节pH值至 4. 0，加入0. 44kg的硫酸钠，继续升温并控制温度在80°C，搅拌30分钟，使蛋白变性沉淀，停 止加热，趁热过滤得滤液21. 6L ；(5)醇沉结晶将步骤⑷中的21. 6L滤液用4. 0mol/L盐酸调节pH值至6. 0，加 入64. 8本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种猪硫酸软骨素的提取工艺，其具体步骤如下：（１）预处理：将新鲜的猪软骨去油脂、肉渣，剪成长度为１～３．５ｃｍ的小碎块；（２）酶解：将处理好的猪软骨碎块放入反应釜中，其中猪软骨的质量含水率为７５％～８２％，按软骨湿重料液体积比１∶３～１∶６ｋｇ／Ｌ的比例加入蒸馏水，加入占软骨碎块湿重０．４％－１．２％的碱性复合蛋白酶，用碱溶液调节ｐＨ值至８．０～９．０，温度控制在４５～６５℃之间，机械搅拌４～１２小时，得酶解液；（３）吸附脱色：将步骤（２）中的酶解液过滤或离心除渣，得滤液或上清液，用酸溶液将滤液或上清液调节ｐＨ值至３～７，加入吸附剂搅拌吸附１～２小时，温度控制在４５～５５℃，趁热过滤得吸附滤液；（４）蛋白盐析：将步骤（３）中的滤液，用酸溶液调节ｐＨ值至４～６，按该滤液体积的１～５％（ｋｇ／Ｌ）加入等重的硫酸盐，继续升温并控制温度在７５～９０℃，搅拌２０～４０分钟，使蛋白变性沉淀，停止加热，趁热过滤得滤液；（５）醇沉结晶：将步骤（４）中的滤液用酸溶液调节ｐＨ值至３～７，向滤液中加入体积质量百分浓度为９５％～１００％的乙醇，使乙醇的最终体积分数达到液体总体积的７０～８５％，静置沉淀８～１２小时，得沉淀物；（６）真空干燥：将步骤（５）中的沉淀物，用脱水剂洗涤３～５次，于５５～６５℃下真空干燥６～１２小时，粉碎即得所述硫酸软骨素成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨文革，胡永红，陈召国，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84
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