一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺，依照下列步骤完成：①选择面积≥50m2、周围有天然或人工栽植的植物饲料并且附近有水源的场地作为增殖室；②在增殖室内搭建用于幼虫养殖的立体梯形平台；③封闭增殖室门窗；④采集龄期在2-2.5龄之间的美国白蛾幼虫，将幼虫摆放在增殖室平台上；⑤向摆放好的美国白蛾幼虫喷施病毒液；⑥收集病死的虫尸放入盛有无菌水的容器内浸泡2-4天，然后用匀浆破碎机研磨粉碎，得到的匀浆液用纱网过滤，过滤出的残渣进行二次研磨，再用同样纱网过滤，即成为美国白蛾多角体病毒液。该工艺技术简单、可提高病毒增殖的数量、降低病毒增殖成本、便于感染病毒死虫的收集，适宜在广大乡村推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种病毒的增殖工艺，特别涉及一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺。
技术介绍
美国白蛾自1979年在辽宁省发现以来，现疫情已在天津、北京、河北等多个省市蔓延。天津蓟县是美国白蛾发生的重点地区，年发生面积4万多公顷，每年投入防治资金 1000多万元，白蛾幼虫在北方年可繁殖2-3代，具有食性杂、适应性强，繁殖量大、传播途径广，危害严重等特点，对林果、农作物及绿色植物都会造成直接危害。美国白蛾核型多角体病毒，是美国白蛾的天然病原体，是美国白蛾幼虫的克星，对美国白蛾幼虫的致死率可达100%，具有高效专一、不杀天敌、不污染环境等优点。但是，目前还不能人工合成，只能依靠活体幼虫进行增殖才能获得大量的病毒。目前，依靠活体幼虫进行增殖获得大量核型多角体病毒的工艺主要有以下两种方法1、围栏增殖。选在灌木林或苗圃中进行，面积大小依据林地情况和增殖量而定，四周用塑料布围住防止幼虫逃逸，按需要从野外采集美国白蛾幼虫投入到围栏内，接种病毒养殖，如食物不足，采集新鲜枝叶随时填加，一周后开始收集虫尸，半月后收集完成。该法优点是就地取材，缺点是受风雨影响大、幼虫容易逃跑、虫体不便收集、单位面积多角体病毒量低。2、工厂化生产。多角体病毒工厂化生产全部工作在控温、控湿室内进行，按需要养殖成虫繁殖幼虫，选用专用饲料，用养虫盒饲养，采用饲料接种病毒。优点是依据需要数量， 可以常年生产。缺点是需购置相关设备、饲料、技术难度大、成本高，不适宜在农村应用。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述现有技术中存在的不足，而提供一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺，该工艺技术简单、可提高病毒增殖的数量、降低病毒增殖成本、便于感染病毒死虫的收集，适宜在广大乡村推广应用。如上构思，本专利技术的技术方案是一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺， 其特征在于依照下列步骤完成①选择面积> 50m2、周围有天然或人工栽植的植物饲料并且附近有水源的场地作为增殖室；②在增殖室内搭建用于幼虫养殖的立体梯形平台，平台底部距地面8-12cm ；③封闭增殖室门窗；④采集龄期在2-2. 5龄之间的美国白蛾幼虫，并将幼虫摆放在增殖室平台上；⑤向摆放好的美国白蛾幼虫喷施病毒液，每天早晚两次连喷3天，以后每天早晚各添加一次新鲜的枝叶，一般需喂养15-18天；⑥收集病死的虫尸放入盛有无菌水的容器内浸泡2-4天，然后用勻浆破碎机研磨粉碎，得到的勻浆液用纱网过滤，过滤出的残渣进行二次研磨，再用同样纱网过滤，即成为美国白蛾多角体病毒液。上述立体梯形平台分为上、中、下三层，下层距地面10cm。上述病毒增殖室的温度在20-25°C之间；相对湿度在70% -85%之间。上述幼虫摆放在增殖室平台上的密度为3500头/m2。上述病毒液的浓度为每毫升含100万个美国白蛾核型多角体病毒。本专利技术具有如下的优点和积极效果1、投资少。本工艺增殖核型多角体病毒投资少，一是不需要建工厂和围栏，不需要设备投资，搭建增殖平台购些竹竿等投资不过几百元。二是喂养的饲料不用购买，就地取材应用充足的天然植物饲料。2、产量高。应用工厂化增殖美国白蛾核型多角体病毒最多养虫1000头/m2，应用围栏法增殖最多养虫500头/m2，应用新工艺增殖美国白蛾核型多角体病毒最多养虫3500 头/m2。本工艺方法增殖病毒是工厂化增殖方法的3. 5倍，是围栏方法的7倍。3、质量好。本工艺方法不改变幼虫原食物种类，有利于幼虫正常生长发育，产出的病毒液质量好。据武汉病毒所检测应用本工艺生产的美国白蛾核型多角体病毒液可达到 328亿/ml，而一般方法生产的美国白蛾核型多角体病毒液仅200亿/ml，病毒数量提高1 亿/ml。4、技术简单。新工艺方法增殖美国白蛾核型多角体病毒比工厂化方法、围栏增殖方法技术简单，不用技术培训容易掌握，最适宜在农村推广应用。具体实施例方式一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺，依照下列步骤完成1、增殖室场地的选择一是增殖室要求面积不低于50m2，通风透光，有照明设施； 二是周围有充足的天然或人工栽植的植物饲料。三是室内或附近有水源，方便配制病毒药液，便于进行病毒增殖工作。2、搭建平台。用粗1.5-2cm竹竿、铁丝、无纺布等材料搭建高100-120cm，上宽60-80cm，下宽 90cm。分上中下3层(长度依实地空间而定)，下层距地面IOcm上窄下宽的立体梯形平台。 平台之间留100-120cm宽的工作道。增殖室配置长60-80cm、宽20cm、高25-30cm的小板凳10条，以备上层操作时可当脚蹬，在收集下层虫尸时当小座用。3、严格封闭门窗。平台搭好后即开始封闭门窗，为保证通风透光采用窗纱封闭门窗，窗子可用单层纱封闭，为了防止幼虫逃逸，门需要采取双层封闭措施，两道封闭线中的间隔距离IOOcm以上，工作人员进出时需随时关好两道封闭门。4、幼虫采集。用于病毒增殖的美国白蛾幼虫龄期应在2-2. 5龄为宜，幼虫野外采集工作应在 1-2天内突击完成为好。采虫时随采随装袋，自然装满扎紧袋子口，存荫凉处，运输时间尽可能缩短，以免幼虫窒息死亡。采集到的幼虫要及时摆放到增殖室平台上，做到虫体分布均勻，合理密度为3500头/m2。5、接种病毒。病毒增殖室温度25°C左右；相对湿度70% -85%最为适宜。按密度摆放幼虫后立即向幼虫体及叶片上喷施病毒液(接种病毒)，使其感染病毒，幼虫接种病毒浓度不宜过大，理想的浓度为每毫升含100万个美国白蛾核型多角体病毒。每天早晚两次连喷3天。以后每天早晚各添加一次新鲜的枝叶，一般需喂养15-18天。6、虫尸收集与病毒的提取。接种病毒7天后，个别龄期小的幼虫开始死亡，要及时捡拾致病死虫，并收集保存。接种病毒10天后死虫进入高峰，17天后幼虫全部老熟可彻底收捡。将收集的虫尸在研磨破碎前3天放入容器加适量无菌水，以淹没虫尸为宜。用勻浆破碎机研磨粉碎，研磨时加入少量水，避免产生高温。勻浆液用120目的纱网过滤，过滤出的残渣进行二次研磨，再用同样纱网过滤，即成为美国白蛾多角体病毒液。7、病毒液浓度的检测与贮存。取混合均勻的病毒原液1ml，稀释1000倍后用血球计数板在电子显微镜下计数， 计数时在计数板一个视野里见到的病毒量太少(每视野低于5个)，可再降低稀释倍数；反之，(每视野多于20个)提高稀释倍数。病毒浓度=(80小格内数量+80) X 400 X IO4X稀释倍数病毒悬液在密闭容器中0-4°C保存，在用于防治时按照施用浓度对水配兑即可。权利要求1.一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺，其特征在于依照下列步骤完成①选择面积>50m2、周围有天然或人工栽植的植物饲料并且附近有水源的场地作为增殖室；②在增殖室内搭建用于幼虫养殖的立体梯形平台，平台底部距地面8-12cm；③封闭增殖室门窗；④采集龄期在2-2.5龄之间的美国白蛾幼虫，将幼虫摆放在增殖室平台上；⑤向摆放好的美国白蛾幼虫喷施病毒液，每天早、晚两次连喷3天，以后每天早晚各添加一次新鲜的枝叶，一般需喂养15-18天；⑥收集病死的虫尸放入盛有无菌水的容器内浸泡2-4天，然后用勻浆破碎机研磨粉碎，得到的勻浆液用纱网过滤，过滤出的残渣进行二次研磨，再用同样纱网过滤，即成为美国白蛾多角体病毒液。2.根据权利要求1所述的立体多本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种立体多层封闭式核型多角体病毒增殖工艺，其特征在于：依照下列步骤完成：①选择面积≥５０ｍ２、周围有天然或人工栽植的植物饲料并且附近有水源的场地作为增殖室；②在增殖室内搭建用于幼虫养殖的立体梯形平台，平台底部距地面８－１２ｃｍ；③封闭增殖室门窗；④采集龄期在２－２．５龄之间的美国白蛾幼虫，将幼虫摆放在增殖室平台上；⑤向摆放好的美国白蛾幼虫喷施病毒液，每天早、晚两次连喷３天，以后每天早晚各添加一次新鲜的枝叶，一般需喂养１５－１８天；⑥收集病死的虫尸放入盛有无菌水的容器内浸泡２－４天，然后用匀浆破碎机研磨粉碎，得到的匀浆液用纱网过滤，过滤出的残渣进行二次研磨，再用同样纱网过滤，即成为美国白蛾多角体病毒液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉书，李银，张绍清，祁振坤，赵占丰，王海燕，孟丽慧，郭志安，李春野，
申请(专利权)人：蓟县林业局林业科技推广中心，
类型：发明
国别省市：12
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