一种预防流感病毒DNA疫苗制造技术

一种预防流感病毒的ＤＮＡ疫苗，其特征在于该疫苗是用ＣＤ４０Ｌ作佐剂的预防流感病毒的ＤＮＡ疫苗，ＨＡ　　ＤＮＡ疫苗与ＣＤ４０Ｌ以１∶１的质量比共同免疫。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种生物制品，具体涉及一种预防流感病毒疫苗。
技术介绍
现有流感生物预防制品及制备方法有如下种类(一)、流感病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗是在完整病毒的基础上，将致病毒粒应用物理或化学的方法使之完全灭活(失去感染性)而制成的病毒疫苗。流感灭活疫苗相较其他疫苗有生产方法比较简单，生产过程容易控制等优势，但也有其明显的缺点。由于制备疫苗用的流感病毒需在鸡胚的尿囊腔中培养生长，制备周期长，免疫原性会被降低或改变。流感的灭活疫苗不具长效性。由它诱导的免疫应答甚至对同源病毒株的效果也很短暂，因此需要每年一次或一年两次接种。(二)、流感亚单位疫苗。流感亚单位疫苗是指由野生流感病毒株经培养、裂解、纯化后得到的有效的病毒表面抗原成分，主要是HA和NA疫苗。但亚单位疫苗的传统制备方法生产工艺相对繁琐，难以大量获取抗原，因此导致亚单位疫苗价格昂贵，难于推广应用。(三)、流感减毒活疫苗。在小鼠中已经证明，流感减毒活疫苗有更为广谱的免疫应答。作为一个有效的疫苗，基因重配的冷适应株必须拥有来源于野生株的编码HA和NA的2个RNA节段，而另外6个片断则必须来源于冷适应供体株。从获得野生病毒株的克隆到制备出减毒活疫苗株大约需要5周时间。在接种人群之前，还必须将疫苗株在特殊的无菌鸡蛋尿囊腔中培养，进一步检测其毒性。对流感减毒活疫苗的减毒处理只是经验性的，且其毒力依然存在回复突变的可能性。尤其对于冷适应疫苗株来说，由于需要多次传代，时间很长，当病毒流行时，将流行毒株进行冷适应性传代并不现实。(四)、流感合成肽疫苗。人工合成的与流感病毒保护性抗原(HA、NA等)决定簇的氨基酸序列相同的肽段，经制备成免疫原后对动物或人体进行接种，可以促使机体产生保护性抗体，这种多肽就是流感的合成肽疫苗。合成肽疫苗存在着一些理论和实际上的困难一是如何找到及构建最佳抗原决定簇的多肽；二是合成肽的免疫原性较弱，使用时必须配用佐剂。由于弗氏佐剂不能在人体使用，故合成肽的临床评价急需研制一种有效、可在人体使用的佐剂。(五)、流感基因工程亚单位疫苗。将编码诱导保护性免疫应答的流感抗原决定簇(HA、NA等)基因插入到表达载体DNA中，然后将载体导入酵母、昆虫或哺乳动物细胞，使之表达病毒抗原蛋白，产物纯化后即得流感的基因工程亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗的不足之处在于阳性表达克隆筛选的工作量大。表达的蛋白有时不能正确折叠或修饰，从而影响免疫原性。重组蛋白分离纯化的工艺有时相对复杂。(六)、流感病毒DNA疫苗。DNA疫苗(DNA Vaccine)是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗由病原体(包括病毒和细菌等)的保护性抗原基因和载体质粒两部分组成。质粒DNA必须具备以下条件①带有细菌复制子(Ori)，保证质粒能在大肠杆菌中复制；②带有用于筛选的抗性基因，筛选基因可以选用卡那霉素，氨苄青霉素或新霉素等抗性基因；③真核生物的启动子(有的含有增强子)，如CMV、SV40启动子；④带有PolyA序列，能保证mRNA在体内的稳定性，这种稳定性因PolyA来源不同而异。目前认为较好的PolyA是来自牛生长激素基因(BGH)。DNA疫苗的导入方式多样，有肌肉注射、皮内注射、鼻内滴注或鼻腔喷雾、脂质体法以及新发展起来的基因枪免疫和活体电击免疫等。流感病毒至今仍是引起人类死亡的主要病因之一，因为流感病毒易突变，所以人类至今仍无法征服流感。疫苗接种是预防流感的一种有效方法，DNA疫苗(DNA vaccine)为我国提供了一种新的选择。1993年，UlmerJB等将编码流感病毒A/PR/8/34的NP基因的质粒注入BALB/c小鼠的股四头肌内，产生了强烈而特异的CTL应答，能够提供交叉保护作用，开创了核酸疫苗用于预防流感病毒的研究；陈则等将HA编码基因克隆入小鸡的β肌动蛋白表达载体中，以3周间隔接种2次，采用基因枪或者活体电击免疫接种的方式，接种剂量为基因枪每只小鼠1μgDNA，活体电击免疫方法每只小鼠30μgDNA。加强免疫后的第七天，用同源病毒株攻击。结果显示，接种HA DNA疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染，因此HA基因应该作为流感DNA疫苗的重要组成部分。DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，DNA疫苗应用于小鼠、绵羊、鸡、猫、牛、猪、马、猴和黑猩猩等动物身上均获得成功，但它在诱导免疫应答中的效率相对较低，影响了它的实际应用，因此寻找其它DNA分子以提高核酸疫苗的免疫效率则是需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在研制一种预防流感病毒用高效DNA疫苗，以提高DNA疫苗的免疫效率。上述专利技术目的是通过以下技术方案实现的。本专利技术疫苗是用CD40L作佐剂的预防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗与CD40L以1∶1的质量比共同免疫。下面进一步详述本专利技术。附图说明图1为病毒攻击小鼠体重丢失(g)和感染后恢复结果图。图2为病毒特异性的血清IgG滴定结果图。图3为共同免疫HA和CD40L(加强免疫后)后小鼠中IgG抗体亚型的水平结果图。CD40L是肿瘤坏死因子超家庭的成员之一，含有261个氨基酸，为II型跨膜糖蛋白，定位于Xq24上，其相对分子量(Mr)为39000。本专利技术的预防流感用高效DNA疫苗是通过如下步骤制备的流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得，HA和CD40L DNA疫苗的构建，HA和CD40L DNA疫苗的鉴定。流感病毒抗原HA和CD40L基因的获得病毒RNA是从在10日龄鸡胚中增殖得到的病毒中提取。RNA经逆转录反应得到单链cDNA。以cDNA为模板，对HA基因进行PCR扩增。正向引物为5’AACCTC GAGAAT GAA GGC AAA CCT ACT GGT CC-3’，反向引物为5’AACCCC GGGTCT CAG ATG CATATT CTG CAC TGC A-3’。正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点。以小鼠脾脏细胞的cDNA文库(Clontech公司)为模板，用PCR方法克隆出CD40L基因，正向引物为5’TTC CTC GAG CAT GAT AGA AAC ATA CAG-3’，反向引物为5’TGA CCC GGG GTA TAG GGA AGA CTG CCA-3’。正向引物含有Xho I酶切位点，反向引物含有Sma I酶切位点。HA和CD40L DNA疫苗的构建低熔点琼脂糖凝胶回收PCR产物，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌，通过质粒提取和酶切鉴定来确定HA、CD40L基因是否已经连入T载体。然后大量扩增鉴定的重组子，纯化回收。带有HA、CD40L基因的T载体用Xho I-Sma I消化，低熔点回收从T载体上切下来的HA、CD40L片段，克隆入经同样酶切处理的表达载体pCAGGSP7中，获得重组质粒pCAGGSP7/HA、pCAGGSP7/CD40L。HA、CD40L基因核苷酸序列经377DNA测序仪(Applied Biosystem.U.S.A.)测序证实。真核表达载体pCAGGSP7来源于由Niwa et al构建的pCAGGSP7，是将多克隆位点Kpn1，Xho1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈则，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：