聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂制造技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种聚乙二醇－灭活疫苗粘膜免疫制剂。本发明专利技术采用药用级聚乙二醇，浓缩、纯化灭活病毒液及制备疫苗，利用聚乙二醇作为免疫佐剂对灭活疫苗蛋白修饰、连接，增强疫苗的稳定性和免疫原性，及局部粘膜免疫应答。经动物实验结果显示，本发明专利技术能延长疫苗在鼻腔的滞留时间，提高鼻粘膜吸收，且对局部鼻粘膜和纤毛无损伤。免疫效果明显高于灭活疫苗，４℃保存，半年后仍然具有免疫原性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫制剂。具体涉及聚乙二醇浓缩灭活病毒疫苗制备粘膜免疫剂。
技术介绍
为预防病毒性感染的呼吸道疾病，如严重急性呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)、病毒性流感及病毒性禽流感等，发展疫苗是十分迫切的需要。鉴于SARS病毒和流感病毒等可在组织细胞中培养，并可达到较高滴度，目前国内外均首选研究灭活疫苗。有研究表明，由于某些病毒发病机理中可能有抗体增强反应(antibody enhancement)，IgG抗体可能在此阶段中产生不良反应；某些病毒的全病毒疫苗(如流感病毒)注射难以诱生局部免疫反应等现象。因此，经病毒自然感染途径进行局部鼻粘膜免疫方式，渐受重视。鼻腔粘膜血管和淋巴管丰富，经局部鼻腔免疫，疫苗易于进入局部淋巴组织，诱导局部免疫应答。经鼻腔免疫可以主要诱生局部IgA抗体，可阻断病毒经呼吸道侵入人体，有效防治呼吸道病毒病的发生和发展。在其他微生物感染，如HIV等已证明局部粘膜免疫可诱生局部免疫应答及一定量的血清抗体。药用级聚乙二醇(PEG)产品无毒、无刺激、具有良好的水溶性，其系列产品应用领域广泛，可作为药剂的辅料。随着新药的不断开发，其用途越来越广，常用作药物载体，分散增溶剂等。已有研究利用聚乙二醇改造医药产品中的蛋白质-多肽类药物，如α与β干扰素、白介素等，经聚乙二醇改造的蛋白质-多肽类药物的结构可延长药物作用时间，减少用药次数，而大大降低使用成本。改良型PEG-干扰素是一种更为有效的乙肝治疗药物，与标准干扰素比较，每周只需注射1次，且接受PEG-干扰素治疗者的显效反应率要高出一倍左右。聚乙二醇化药逐渐增多，如PEG化喜树碱、PEG化紫杉醇、PEG化多肽类药物和PEG化抗高血压药物等。局部鼻粘膜免疫一般采用滴鼻或喷雾给药。滴鼻疫苗以在鼻腔局部滞留时间较长而吸收良好为佳，同时疫苗病毒的浓度高而体积小并有利于疫苗制剂的稳定，且对鼻粘膜不产生刺激作用。目前进行的研究的疫苗控释制剂主要是微球或其它微粒制剂，通过材料的选择和包裹程度，可控制疫苗释放速度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强稳定性和免疫原性的聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂。具体涉及聚乙二醇浓缩灭活病毒疫苗制备粘膜免疫剂。本专利技术聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂采用药用级分子量4000～10000的聚乙二醇，浓缩、纯化灭活病毒液及制备疫苗，利用聚乙二醇作为免疫佐剂对灭活疫苗蛋白修饰、连接，增强疫苗的稳定性和免疫原性。本专利技术所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亚单位疫苗，所述的灭活病毒可以是经呼吸道感染的病毒，如流感病毒、SARS冠状病毒等。本专利技术通过下述方法和步骤进行，采用20-35％药用级聚乙二醇按1∶2～1∶5的比例，加入已灭活的病毒培养液，按常规方法孵育24～72小时，经聚乙二醇连接的病毒通过高速离心浓缩纯化，病毒沉淀物溶解于磷酸缓冲盐水使浓缩50～200倍，即制成粗制灭活病毒粘膜免疫制剂。本专利技术聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂其中聚乙二醇的使用浓缩可根据不同疫苗进行调节。本专利技术的优点在于采用聚乙二醇不仅作为疫苗浓缩和纯化的制剂，而且可作为疫苗的缓释剂以延长疫苗在鼻腔的滞留时间，提高鼻粘膜吸收，且对局部鼻粘膜和纤毛无损伤。同时聚乙二醇将灭活疫苗蛋白连接的作用，具有增强免疫应答的佐剂作用，特别是对粘膜免疫疫苗制剂，不仅可诱生局部免疫应答产生分泌型IgA抗体，而且可诱导全身免疫应答，血清中出现保护性抗体。本专利技术将聚乙二醇(药用级)作为滴鼻病毒疫苗缓释液，能增强疫苗的稳定性，同时增强疫苗的免疫原性，特别是增强局部粘膜免疫应答，具有佐剂样的作用。附图说明图1是免疫小鼠血清抗SARS冠状病毒的中和抗体效价，图2是PEG-灭活SARS病毒疫苗粘膜免疫剂免疫小鼠的气管-肺盥洗液中抗SARS FITC-IgA的检测结果。具体实施例方式实施例1 聚乙二醇浓缩灭活SARS冠状病毒将药用级聚乙二醇6000配制成35％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶5量加入已灭活的SARS冠状病(CGMCC No.0977)毒液，置4℃孵育24小时。离心13,000rpm，30分钟。去除上清，沉淀物溶于磷酸缓冲液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒浓缩至100倍，得粗制灭活SARS冠状病毒粘膜免疫制剂。实施例2 聚乙二醇浓缩灭活裂解甲型流感病毒将药用级聚乙二醇8000配制成30％聚乙二醇/1.75M NaCl。按1∶4量加入已灭活的裂解甲型流感病毒液，H3N3巴拿马株(2003年国内应用的生产株)置4℃孵育24小时。离心13,000rpm，30分钟。去除上清，沉淀物溶于磷酸缓冲液(0.01M PBS，PH7.2)，使病毒浓缩至50倍，得粗制灭活禽流感病毒粘膜免疫制剂。实施例3 聚乙二醇增强滴鼻SARS冠状病毒疫苗的免疫原性SARS冠状病毒(G250)灭活疫苗，免疫剂量每只小鼠50μg；PEG-SARS冠状病毒灭活粘膜免疫制剂，免疫剂量每只小鼠20μg，分别经滴鼻免疫Balb/c小鼠，每隔2周免疫1次，共免疫4次。第4次将强免疫后2周将小鼠处死，取血分离血清，并用磷酸缓冲液灌洗小鼠的气管和肺。血清和气管-肺灌洗液保存于-70℃，待检。血清用于检测抗-SARS冠状病毒的中和抗体；气管-肺灌洗液用于检测抗-SARS冠状病毒IgA(间接免疫荧光法)。结果显示PEG-灭活疫苗滴鼻剂的免疫明显高于灭活疫苗，(阴性结果，细胞不显荧光)，血清中和抗体效价高于单独灭活疫苗，更为有意义的是PEG-PEG-灭活疫苗滴鼻剂局部诱导的粘膜免疫应答(IgA)明显高于单独灭活疫苗以及氢氧化铝-灭活疫苗，提示聚乙二醇通过使病毒颗粒之间连接可以增强疫苗的免疫原性，特别是增强局部粘膜免疫应答，具有佐剂样的作用。此外，上述灭活病毒通过聚乙二醇连接后分子变大，蛋白稳定时间延长，4℃保存，半年后仍然具有免疫原性。表1是间接免疫荧光检测免疫小鼠气管-肺灌洗液中抗-SARS冠状病毒IgA。表1Immunized The way ofMouseFluorescence intensity of IF-IgA*Groups inoculation numberSARSV-alum s.c. 2 - -SARSV i.n. 5 - - -- ±SARSV-CpG i.n. 5 ++ + +±±SARSV - i.n. 5 +++ +++ ++ + ±SARSV-PEG i.n. 5 ++ ++ ++ ++ ++权利要求1.聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是以药用级分子量4000～10000的聚乙二醇，浓缩、纯化灭活病毒，制成疫苗粘膜免疫剂。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是所述的灭活病毒是经呼吸道感染的病毒。3.根据权利要求1所述的聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是所述的灭活病毒是流感病毒或SARS冠状病毒。4.根据权利要求1所述的聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是所述的疫苗可以是蛋白疫苗或亚单位疫苗。5.根据权利要求1所述的聚乙二醇-灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是所述的聚乙二醇浓度为20-35本文档来自技高网...

【技术保护点】
聚乙二醇－灭活疫苗粘膜免疫剂，其特征是以药用级分子量４０００～１００００的聚乙二醇，浓缩、纯化灭活病毒，制成疫苗粘膜免疫剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿涤，闻玉梅，姚忻，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]