流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括一步5xRT-PCR?Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Enzyme?Mix；依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物，AF：5'-ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3'，AR：5'-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3'；依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物；依据流感病毒甲型H1N1型的HA基因设计特异性引物。本发明专利技术测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；能进行病毒定性分析；检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中的PCR试剂盒，尤其涉及一种流感病毒一步 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反 应)检测试剂盒。
技术介绍
流感病毒属于正粘病毒科，分节段单股负链RNA病毒。根据其核蛋白和基质蛋白 抗原性不同，流感病毒主要分为A、B和C型或者称为甲、乙和丙三种类型。其中A型流感 病毒可以感染人类、禽类和其他一些哺乳动物，如猪等。而B型和C型流感病毒主要是感 染人类。据流行病学调查显示，目前引起人群流行性感冒流感的主要是流感病毒A型和B 型。2009年4月在墨西哥暴发并导致全球广泛传播和数百人死亡的流感病毒被命名为甲型 HlNl流感病毒，该病毒属于A型流感病毒的Hmi亚型，它是猪流感病毒，人流感病毒和禽流 感病毒通过基因片段重组后产生的一种新型混合型病毒株。针对流感病毒建立快速高效的 实验室检测技术，对于疑似病人的及时诊断和治疗以及卫生检疫部门和国家疾控部门开展 有效的传染病监控和流行病学调查研究等都具有非常重要的意义。根据防控甲流的实际需 要，建立了在一个反应管内能同时筛查A型B型和新型甲型Hmi流感病毒的RT-PCR技术， PCR技术的优点有高灵敏度、高特异性、高精确性，为快速检测工作中发挥了重要作用。目前在感染的早期及时采用抗病毒类药物治疗流感患者效果显著治愈率高因此 为了早诊断早治疗针对疑似患者的流感病毒实验室快速筛查技术显得非常重要且意义重 大实时荧光定量RT-PCR技术是一项快速准确和特异的流感病毒核酸检测技术。但是该技 术的主要缺点是由于荧光标记探针的使用造成检测成本很高。此外当采用荧光RT-PCR技 术同时检测A型B型和甲型Hmi等多种流感病毒型别时实验操作将变得非常繁琐成本也 会成倍增长。临床医院等在应对全球性流感大流行的疫情监控工作中建立低成本，能同时 检测流感病毒多种型别的普通多重RT-PCR技术显得更具实用价值，多重RT-PCR技术是在 单一 RT-PCR技术的基础上发展起来的新技术通过多对引物组合，可以实现在一个PCR反应 体系中同时扩增多个靶序列这样即节约时间和精力又节约了试剂，并且其扩增的特异性和 效率与单一 PCR相当。因此该技术非常适合于实验室用于应对长时期大样本的临床筛检任 务。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种流感病毒一步 RT-PCR检测试剂盒。本专利技术的目的是这样实现的1、流感病毒一步RT-PCR检测试剂盒(简称试剂盒)本试剂盒是在对流感病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出三对 特异性引物，利用PCR技术对流感病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现 对流感病毒的检测。具体地说，本试剂盒包括一步hRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、三对特异性 引物和 Enzyme Mix ；①依据流感病毒A型的M基因设计特异性引物AF 5 ’ -ATTCTAACCGAGGTCGAAACGT-3’ 22bp，AR :5，-GACAAAGCGTCTACGCTGCAGTC-3，23bp ；依据流感病毒B型的NS基因设计特异性引物BF :5，-AGGGACATGAACAACAAAGATT-3，22bp,BR :5’ -GATGTCAGCTATTATGGAGCTC-3’ 22bp ；依据流感病毒甲型Hmi型的HA基因设计特异性引物HlNlF 5，-AAATAACATTMGAAGCAACTGGT-3，23bp，HlNlR :5，-GAGGCTGGTGTTTATRGCACCC-3，22bp ；②阳性对照分别连接有设计流感病毒A、B型、甲型Hmi型引物的基因保守序列的pGBKT-7克 隆载体；③阴性对照RNase Free H2O ；④5 X RT-PCR Buffer 配制Tris-HCl250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mMdNTPIOmM配置混合后于冰箱-20 V保存；⑤ Enzyme Mix 配制Tris · Cl KCl DTT EDTANonidet P-40 Tween 20 甘油 iTaq 酶 M-MLV 酶配置混合后于冰箱-20 V保存。2、试剂盒的使用方法①病毒核酸的提取A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液 中力口入 30 μ g/ml carrier RNA ；B、取30 μ 1蛋白酶放入1. 5ml离心管中；C、将标本(如咽拭子、痰液等)取200 μ 1加入此管中，充分混勻；D、再在每管分别加入200 μ 1漂洗液(含30 μ g/ml carrier RNA)，混勻振荡30s， 70°C温育 IOmin ；E、加入250 μ 1无水乙醇，充分混勻振荡30s，室温裂解5min ；F、将上述裂解液加入离心柱中，SOOOrpm，离心lmin，弃收集管中的离心液。滤柱仍 放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；G、滤柱中加入500 μ 1缓冲液1，12000rpm，离心lmin，弃收集管中的离心液；H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加 Λ 500 μ 1缓冲液2，12000rpm,离心lmin,重复步骤⑧一次；I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm,离心!Bmin，后将滤柱放在 370C 15min以干燥滤膜；J、将滤柱放在1. 5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase_free H2O,室温静 置anin。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。 ②一步RT-PCR扩增(每份25ul体系)取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul —步RT-PCR反应液至PCR管中进行PCR扩增。A、一步RT-PCR反应液(mix)的配制20mM 80mM ImM 0. ImM 0. 5% 0. 5% 50% 2. 5U/ul 2. 5U/ul一步 5 X RT-PCR buffer6ulEnzyme Mix5ul三对特异性引物F/R各IulRnase Free H2O_3ul_反应液体积20ulB、一步RT-PCR反应程序a、50 °C30minb、95°C5minc、94°C30sd、60°C30se、72°CIminf> Go toc，45个循环；C、检测仪器本专利技术使用ABI Veriti Thermal Cycler PCR 仪进行检测。D、结果判断所得到的DNA产物，使用2%的琼脂糖凝胶跑电泳，使用照胶仪来分析检测。如泳道中无条带显示则为阴性，有条带显示为阳性；如泳道只有一条带显示为230bp为流感病毒A型；如泳道只有一条带显示为5(^bp为流感病毒B型；如泳道有两条带显示为230bp和155bp为流感病毒甲型Hmi型。本专利技术具有下列优点和积极效果①测时间周期短、检测效率高；②检测病毒特异性高，准确率高；③能进行病毒定性分析；④检测灵敏度比免疫学检测方法灵敏度高；⑤操作简单、易于推广；本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种流感病毒一步ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于：本试剂盒包括一步５ｘＲＴ－ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、阳性对照、阴性对照、三对特异性引物和Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ；①依据流感病毒Ａ型的Ｍ基因设计特异性引物ＡＦ：５’－ＡＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣＧＴ－３’　２２ｂｐ，ＡＲ：５’－ＧＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣ－３’２３ｂｐ；依据流感病毒Ｂ型的ＮＳ基因设计特异性引物ＢＦ：５’－ＡＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴ－３’２２ｂｐ，ＢＲ：５’－ＧＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣ－３’２２ｂｐ；依据流感病毒甲型Ｈ１Ｎ１型的ＨＡ基因设计特异性引物Ｈ１Ｎ１Ｆ：５’－ＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＭＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴ－３’２３ｂｐ，Ｈ１Ｎ１Ｒ：５’－ＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＲＧＣＡＣＣＣ－３’　２２ｂｐ；②阳性对照分别连接有设计流感病毒Ａ、Ｂ型、甲型Ｈ１Ｎ１型引物的基因保守序列的ｐＧＢＫＴ－７克隆载体；③阴性对照ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏ；④５×ＲＴ－ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ配制配置混合后于冰箱－２０℃保存；⑤Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ配制配置混合后于冰箱－２０℃保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建国，石康，艾洪武，刘映乐，刘为勇，熊鹰，程议锋，项荣，汤行春，李彤亚，章琪，胡晓静，王妍，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83