一种大批量提取蚯蚓基因组DNA的方法技术

一种大批量提取蚯蚓基因组DNA的方法。本发明专利技术涉及土壤污染分子诊断中蚯蚓基因组DNA的提取技术，蚯蚓是分子生态毒理学研究和土壤污染分子诊断中常用的模式生物。该方法在蛋白酶K法的基础上进行了改进，蚯蚓头部3mm处的体节作为提取的起始样本，采用与离心管内壁相匹配的玻璃研磨杵在离心管内直接对样本进行研磨破碎；在进行酚仿抽提之前，增加一步离心操作，大大提高了蚯蚓组织消化的效率，并有效避免蚯蚓肠胃内的泥沙对核酸提取的干扰，使整个提取过程在5小时之内完成。本方法提高了蚯蚓基因组提取的成功率和效率，并具有省时省力的优点，本方法得到的高质量基因组DNA适合酶切和PCR等下游实验。

Method for extracting earthworm genome DNA in large quantity

Method for extracting earthworm genome DNA in large quantity. The present invention relates to the extraction technique of earthworm genomic DNA in molecular diagnosis of soil pollution, and earthworm is a model organism commonly used in molecular ecotoxicology research and soil pollution molecular diagnosis. This method is based on proteinase K method was improved, the head 3mm metameres as initial samples, using a glass pestle matched with centrifugal tube wall in centrifuge tube directly to sample grinding; before the phenol chloroform extraction, an additional step of centrifugal operation, greatly improving the efficiency earthworm tissue digestion, and effectively avoid the interference of earthworms in the intestines and stomach sediment nucleic acid extraction, the extraction process is completed within 5 hours. The method improves the success rate and efficiency of earthworm genome extraction, and has the advantages of time saving and labor saving, and the high-quality genomic DNA obtained by the method is suitable for downstream experiments such as enzyme digestion and PCR.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提取蚯蚓基因组DNA的方法，可用于需要获得大批量，高质量蚯 蚓基因组DNA的研究领域，如土壤污染的分子诊断领域。
技术介绍
由于污水灌溉，化肥和农药的滥用、工农业固体废物的不合理填埋等人类活动，土 壤污染在我国和世界范围内变得越来越严重，人类对土壤污染的诊断，检测和修复工作变 得越来越重视，利用生物标记物作为监测和诊断土壤污染正成为一种非常有前景的技术手 段。 蚯蚓作为分子生态毒理学和土壤生态学研究中一种重要的模式生物，广泛应用于 土壤污染的诊断、监测和修复，学科的发展和分子诊断的需要使得高效提取蚯蚓高质量基 因组DNA的方法显得尤为重要。目前，涉及提取各种生物和各种样本的基因组DNA的方法有 很多，如SDS法，CTAB法和蛋白酶K法。然而蚯蚓并不是生物学研究中常用的模式生物，到 目前为止没有一种合适的方法用来提取蚯蚓基因组DNA。 蛋白酶K是一种枯草蛋白酶 类的高活性蛋白酶，其原理是利用蛋白酶K消化组织和细胞中的蛋白质，使聚合在染色体 上的基因组DNA从组蛋白上脱落下来并溶解，然后通过酚仿抽提，去除蛋白质和其它杂质， 经过经典的沉淀方法得到基因组DNA。传统的蛋白酶K法用于动物组织和细胞(如小鼠，人 的细胞和组织)的基因组DNA提取。然而，蚯蚓却有其特殊性，它的泥沙含量很高，泥沙和杂 质抑制了蛋白酶K的作用，使得消化不完全，通常含有泥沙的蚯蚓组织在进行蛋白酶K消化 后，消化液浑浊发出恶臭，DNA降解。另外，蚯蚓组织的肌肉蛋白质含量很高，这也使得蛋白 酶K消化变得困难，因此在蛋白酶K消化之前对组织进行充分的破碎研磨显得尤为重要。 组织的破碎研磨有很多种方法，如液氮研磨、超声破碎，玻璃勻浆器勻浆等，上述方法各有 优点，各有其适用的领域。如液氮研磨对组织破碎的效果较好，同时液氮的低温能抑制组织 内源的核酸酶对DNA的降解；超声破碎对细胞和幼嫩组织的破碎效果较好，配合仪器使用 更方便；玻璃勻浆器勻浆法的破碎效果也很好，但耗时久，很难保证DNA不被降解。液氮研 磨和玻璃勻浆器勻浆由于需要转移样品，均不适合大批量样本的操作，而超声破碎不适合 坚韧组织的破碎，并且需要仪器的配合使用。综上所述，普通的研磨方法都有缺陷，且因为 需要转移样本而费时费力，上述研磨破碎的方法均满足不了土壤污染的分子诊断研究中对 大批量高质量蚯蚓基因组DNA的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决传统蛋白酶K法提取蚯蚓基因组存在消化不完全、消化液浑 浊发出恶臭、DNA大部分降解以及消化时间长等问题，提供一种大批量提取高质量蚯蚓基因 组DNA的新方法。本专利技术在传统的蛋白酶K法的基础上，针对蚯蚓这种生物组织肌肉含量高且较坚 韧的特点，通过特殊的取样方法，玻璃研磨杵的直接研磨和额外增加一步离心操作，提高了 组织破碎、蛋白酶K消化和DNA纯化的效率，简化了下游的操作，提高了基因组DNA的纯度和质量。本专利技术提供的大批量提取蚯蚓基因组DNA的方法，包括以下步骤第1、特殊的取样部位，夹取蚯蚓头部3 mm (从咽部往前的约10个体节)处的体节，作 为基因组DNA提取的起始样本，置于1.5 mL离心管(印pendorf管)中；第2、采用与离心管内壁相匹配的玻璃研磨杵，在离心管内直接对第1步夹取的样本进 行研磨； 第3、采用改进的蛋白酶K法对第2步研磨破碎后的样本进行基因组DNA的提取，获得 所要提取的蚯蚓基因组DNA ；所述的改进的蛋白酶K法，就是在进行酚仿抽提之前，增加一 步离心操作，使得残留的固体杂质沉淀在离心管底部，从而避免固体杂质对后续操作的影 响，提高基因组DNA的质量和纯度。具体提取过程一、实验材料及试剂的准备该新方法所用的玻璃研磨杵购自市场。实验中涉及的其他材料均为分子生物学实验中 的常用试剂材料。各种溶液的制备参照《分子克隆实验手册》第三版SNET溶液20 mmol/L Tris-Cl (pH8. 0) ；5 mmol/L EDTA (pH8. 0) ；400 mmol/L NaCl ； 1% (m/V) SDS ；用0.43 μ m的滤器过滤除菌。裂解液每500 uL裂解液含480 uL SNET禾口 20 uL蛋白酶K (20 mg/mL) (苯酚氯仿异戊醇)混合溶液按照体积比25:24:1配制，并用1Μ，ρΗ 8. 0的Tris缓冲液平衡。(氯仿异戊醇)混合溶液按照体积比24:1配制。75% (ν/ν)乙醇溶液将无水乙醇和重蒸水按照体积比3:1混合。10倍TE溶液(pH8. 0):100 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)， 将上述溶液混合后调PH到8. 0lmol/L Tris-CKpH 8.0)缓冲液用80 mL蒸馏水溶解12. 11 g Tris碱，加浓盐酸 4. 2 ml 调至 pH8. 0蛋白酶K溶液储存液含蛋白酶K浓度为20 mg/ml，蛋白酶K的工作浓度为400 ug/ml RNase A溶液储存液含RNase A为20 mg/ μ L,工作浓度应彡20 ug/mg。二、操作步骤1、为了避免泥沙干扰基因组提取过程，在取样时用镊子夹取蚯蚓头部不含泥沙的组织 约30mg (长度约3 mm)放置于1. 5 mL离心管(印pendorf管)中，加50 uL裂解液。2、在冰上，用玻璃研磨杵充分研磨蚯蚓组织，尽量使组织碎裂。再加入450 uL裂 解液，颠倒混勻。3、55°C温浴4小时(不超过12小时)，经过蛋白酶K彻底消化，离心管内应呈透明 淡黄色液体。结束消化后，待温度降到室温，加10 uL 20 mg/ uL的RNase A，37°C温浴半小 时以去除RNA。4、为避免肉眼不可见的固体杂质干扰DNA提取，12000 rpm离心lmin，使未消化的 固体杂质沉淀在1. 5 mL离心管(印pendorf管)底部。5、酚仿抽提，在1.5 mL离心管(印pendorf管)内加入500 uL的(苯酚氯仿异戊醇)混合溶液，将离心管水平放置于摇床上，常温，200转/min震荡15 min-30 min。6、将1.5 mL离心管(印pendorf管)从摇床中取出，12000 rpm离心5min_10min。7、小心吸取上清到另一个1. 5 mL离心管(印pendorf管)中，加500 uL (氯仿异 戊醇)混合溶液，将离心管水平放置于摇床上，常温，200转/min震荡15 min-30 min。8、将1.5 mL离心管(印pendorf管)从摇床中取出，12000 rpm离心5min_10min。9、小心吸取上清到另一个1. 5 mL离心管(印pendorf管)中，然后加1倍体积的 冰上预冷的异丙醇，颠倒混勻后静置15 Hiin-Ih010、4°C，12000 rpm 离心 15min 收集沉淀。11、弃上清，用微量移液器尽量吸干所有液体。加1 mL75% (ν/ν)乙醇溶液洗涤 DNA沉淀，上下颠倒。12000 rpm离心1 min。12、重复步骤11 用1 mL75% (ν/ν)乙醇溶液再次洗涤沉淀。13、弃上清，用微量移液器尽量吸干所有液体。将离心管敞口放置10 min-15 min。14、加100 uL的TE溶液(pH8. 0)或pH 8. 0的重蒸水本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种大批量提取蚯蚓基因组ＤＮＡ的方法，其特征在于该方法的３个具体步骤，包括：第１、夹取蚯蚓头部３　ｍｍ处的体节，作为基因组ＤＮＡ提取的起始样本，置于１．５　ｍＬ离心管中；第２、采用与离心管内壁相匹配的玻璃研磨杵，在离心管内直接对第１步夹取的样本进行研磨破碎；第３、采用改进的蛋白酶Ｋ法对第２步研磨破碎后的样本进行基因组ＤＮＡ的提取，获得所要提取的蚯蚓基因组ＤＮＡ；所述的改进的蛋白酶Ｋ法，就是在进行酚仿抽提之前，增加一步离心操作，使得残留的固体杂质沉淀在离心管底部，从而避免固体杂质对后续操作的影响，提高基因组ＤＮＡ的质量和纯度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何康信，周启星，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12