用于抑制植物病原菌的博落回生物碱及其制备方法技术

本发明专利技术涉及用于抑制植物病原菌的博落回生物碱及其制备方法。本发明专利技术所述的生物碱是从博落回全草中提取出来的总生物碱及其４种主要的单体生物碱：血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和α－别隐品碱。本发明专利技术首次明确博落回生物碱对植物病原细菌和真菌具有明显的抑制活性，其中血根碱和白屈菜红碱的抑制活性最强。博落回总生物碱及其单体生物碱可用于防治植物病害。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及博落回生物总碱和主要单体生物碱的制备及其对植物病原真菌和细菌的抑制作用，属于农 药

技术介绍
博落回(Mac/e《戸coWato(Willd.)R. Br.)在分类上属于罂粟科(Papaveraceae)博落回属，为多年生 高大草本，主要生长于海拔120-180米的丘陵或低山林的灌丛或草丛中，分布在我国的贵州、广西、广东、 福建、江西、湖南、湖北、安徽、浙江、江苏、河南、陕西、甘肃南部等省份，少量分布在日本中部。博 落回是重要的药用植物，具有杀虫、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。博落回中总生物碱含量约占全草干重 的1%,为异喹啉类生物碱。生物碱被认为是博落回的主要生物活性成分。目前尚未见博落回生物碱对根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌等植物病原细菌，以及 番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉、水稻纹枯病菌、 苹果轮纹病菌等植物病原真菌的抑制作用报道。本专利技术着重于博落回总碱及其主要单体生物碱的制备，以及生物碱对上述植物病原细菌和真菌的抑制 活性，为新型植物源杀菌剂的研究与开发提供依据。为了保护环境和人类，以及维持农业的可持续发展，急需不断研制高效、低毒、低残留的环境相容型 农药。本专利技术的目的是提供博落回生物碱作为高效抗菌剂在抑制植物病原真菌和病原细菌上应用的例子。
技术实现思路
本专利技术涉及博落回生物总碱和主要单体生物碱的制备及其对植物病原真菌和细菌的抑制作用，提供如 下的技术方法。1、 博落回生物总碱的制备采用酸提碱沉方法得博落回总生物碱，得率为0.7% (g/g干重)。2、 博落回主要生物碱的分离与结构鉴定采用多种柱层析并结合活性追踪分离的方法，从博落回总碱中分离并鉴定出血根碱、白屈菜红碱、原 阿片碱和a-别隐品碱等4个异喹啉类生物碱。3、 博落回生物碱对细菌的抑制作用釆用多孔板生长速率法，测定血根碱和白屈菜红碱对根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌和番茄细菌斑点病 菌具有明显的抑制作用(表3)。4、 博落回生物碱对稻瘟菌孢子萌发的抑制作用博落回主要单体生物碱血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和a-别隐品碱对稻瘟菌孢子萌发具有明显的抑制作用，半抑制浓度在10 pg/mL到40 ng/mL之间(表4)。 5、博落回生物碱对真菌生长的抑制作用采用液体培养基生长速率法，测定血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和a-别隐品碱对番茄灰霉病菌、苹 果轮纹病菌、小麦赤霉、番茄枯萎病菌、棉花枯蒌病菌、水稻纹枯病菌的生长均具有明显的抑制作用(表 5)。本专利技术的优点本专利技术首次明确了博落回生物碱具有广谱的抗植物病原细菌和真菌的活性，主要的抗 菌活性生物碱为血根碱、白屈菜红碱、原阿片碱和a-别隐品碱。目的是利用植物资源，获得抗菌活性成 分，为植物源农药的研究与开发，为探讨植物次生代谢成分的生理生态功能提供依据。为了更好地理解本专利技术，下面结合本专利技术的实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容 并不局限于此。具体实施例方式实施例l:博落回总碱的制备于秋天采集博落回全株，凉干后粉碎，取3 kg粉末，用2倍体积1%硫酸室温下提取3次(每次3天)， 滤液用氢氧化钠调pH值至9，得沉淀物。将沉淀物用1 L95。/。乙醇于80°C下回流提取3次(每次5小时)， 提取液用50。/。硫酸酸化至pH2，生物碱成盐析出，过滤，即得博落回总生物碱21g，计算总生物碱含量为 植物干重的0.7%。实施例2:博落回总碱对植物病原细菌的抑制活性用实施例1中所述的方法制备到总生物碱，采用打孔药剂扩散法，测定博落回总生物碱对植物病原细 菌的抑制活性。(1) 活性测定的植物病原细菌菌株供试细菌包括根癌土壤杆菌Ugro6am'鹏/鹏e/ac/esATCC 11158)、黄瓜角斑病菌(尸set^owoas /ac/w7附ara ATCC 11921)和番茄细菌斑点病菌(A-aAomowos ww'caton'aATCC 11633)。上述供试菌株长期保存在-20。C下，在活性测定前，需要在LB平板上对供试细 菌进行活化培养(28°C,暗)48h,然后挑取单菌落，在LB液体培养基中摇培(28°C，暗，150rpm)24h， 然后继代培养8-12h,菌液浓度达到109cfb/mL，即可用于活性测定。(2) 培养基采用LB琼脂培养基(酵母浸膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L，琼脂20 g/L， pH 7.0)和LB液体培养基(酵母浸膏5 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L, pH 7.0)。(3) 抗菌活性测定采用打孔药剂扩散法测定。具体测定步骤为卯mm直径的培养皿中盛3%的水 琼脂10mL，冷却凝固后加入15mL含150^L菌液(109cfu/mL)的LB培养基(45°C),待上层凝固后，用无菌打孔器打孔(直径5mm),每孔中加入浓度为5 mg/mL (用DMSO配制)的博落回生物总碱溶液40 HL、或者0.2mg/mL (用DMSO配制)的硫酸链霉素溶液40 (阳性对照)、或者DMSO溶液40 (阴 性对照)，在28。C下培养过夜后，采用十字交叉法测定抑菌区域的直径。每个处理重复3次。 (4)实验结果结果见表l，博落回总生物碱对供试细菌具有较好的抑制活性。表l博落冋总生物碱的抗细菌活性<table>table see original document page 5</column></row><table>注每孔中博落回总碱的量为0.2mg，硫酸链霉素的量为8.0ng。实施例3:博落回总生物碱对植物病原真菌的抑制活性用实施例1中所述的方法制备得到总生物碱，釆用带毒平板菌丝生长速率法，测定博落回总生物碱对 植物病原真菌的抑制活性。(1) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):配制1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar, PDA) 的步骤为将洗净去皮的马铃薯200 g,切成小块，加去离子水1000 mL,煮沸30min,过滤，取滤液， 加琼脂20g和葡萄糖20g，加热使琼脂融化后，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000 mL。 121 。C 湿热灭菌20min。该培养基用于真菌的活化培养、继代培养和抗菌活性测定。(2) 供试的植物病原真菌供试真菌包括番茄早疫病菌/toa/7'aso/a/)、黄瓜枯萎病菌(Fw^n'wm o砂sj7orM/M f.sp. CMCwwen'witfw)、 番莉枯妻病菌(Fiisan'M/n cwQAsporwm f.sp. (yco;pera/cZ)、 棉花枯菱病菌(FMjar/Mm ojqyspo,'w附f.sp vos/wyk^i/加)、水稻纹枯病菌(i /j/z。ow.a so/a/)。上述供试的植物病原真菌菌 株长期保存在4。C下，在活性测定前，需要在PDA平板上对供试真菌进行活化培养(25°C，暗)5-10天， 然后继代培养l-2次，即可用于活性测定。(3) 实验设计与操作采用带毒平板菌丝生长速率法，测定生物总碱对真菌菌丝生长的抑制作用。 将生物总碱配成系列浓度的母液200 mg/mL、 100 mg/mL、 25 mg/mL、 10 mg/mL、 5 mg/mL (针对本文档来自技高网...

【技术保护点】
博落回生物碱在制备抑制植物病原菌药物中的应用。

【技术特征摘要】
1、博落回生物碱在制备抑制植物病原菌药物中的应用。2、 一种按权利要求1所述的博落回生物碱，其特征是博落回全草经干燥后粉碎，采用酸提碱沉方法 获得总生物碱。3、 一种按权利要求1所述的博落回生物碱，其特征是总生物碱的含量为植物干重的0.7%。4、 一种从按权利要求1所述的博落回总生物碱中分离到血根碱的方法，该化合物对植物病原细菌和 病原真菌具有抑制活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：周立刚，王敬国，姜微波，郭泽建，李晓林，刘浩，谈满良，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]