一种重组鸡β干扰素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种体外高效制备鸡β干扰素的方法及其应用。主要技术方法如下：利用PCR的方法从鸡肝基因组中扩增出鸡β干扰素基因，将该基因连接到PET28a载体上,构建出重组鸡β干扰素成熟蛋白基因重组载体并转入BL-21大肠杆菌表达系统。鸡β干扰素在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的鸡β干扰素的包涵体经过高浓度尿素变性后，经NI-NTA的亲和层析柱纯化，收集洗脱峰并用梯度尿素浓度溶液复性。本发明专利技术中的重组鸡β干扰素具有很好的抗病毒的生物学活性，且生产成本低，生产效率高，生物活性好，非常适合企业化生产。

Preparation method of recombinant chicken interferon and its application

The invention belongs to the technical field of molecular immunology, in particular to a method for preparing chicken interferon beta in vitro and its application. The following main methods: use PCR method to amplify chicken interferon beta gene from the chicken genome, the gene was cloned into PET28a vector, the recombinant chicken beta interferon mature protein gene vector and transferred into Escherichia coli expression system BL-21. Chicken interferon beta was highly expressed in Escherichia coli, chicken beta interferon expression in inclusion body after high concentration urea denaturation, purification by affinity column NI-NTA, collected and refolded by gradient elution peak concentration of urea solution. The recombinant chicken interferon beta has good antiviral biological activity, and has the advantages of low production cost, high production efficiency and good biological activity, and is very suitable for industrial production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子免疫学
，具体涉及一种体外高效制备鸡β干扰素的方法及其应用。
技术介绍
β干扰素是一种重要的I型干扰素，主要是由成纤维细胞和白细胞在病毒核酸、 多聚肌苷酸多聚胞苷酸(Poly IC)等干扰素诱生物质刺激下所分泌的一种糖蛋白。β干扰素不仅在抗病毒固有免疫过程中发挥着重要作用，而且具有抗肿瘤、抗增殖和免疫调节等功能。在一些α干扰素使用失败的病例(多发性硬化症)或效果欠佳的病例(严重急性呼吸综合症，SARS)中，β干扰素能够发挥非常好的效果。从β干扰素的科研价值和临床应用的价值来推测，鸡β干扰素在鸡相关疾病的防制和科研研究中必将会起一定的作用。但是要使鸡β干扰素在兽医临床上和基础研究中得到应用，必须先获得在体外大量生产鸡β干扰素的能力。目前，在国内，鸡干扰素相关的研究中，鸡β干扰素的研究还很少，现有的研究有内蒙古农业大学的关平原教授实验室的银晓博士对鸡β干扰素的基因进行了克隆，并采用PGEX-2T载体对其进行了融合表达。但是鸡β干扰素是一种生物活性物质，融合表达的鸡β干扰素其生物活性会受到很大影响。另外，南京农业大学陈伟业博士在CHO细胞中表达了鸡β干扰素基因。一般来说，用真核细胞表达的外源蛋白具有生物活性好的优点， 但是也存在表达量少的缺点，且研究表明利用真核细胞宿主系统达到鸡β干扰素产业化生产，需要企业有严格的细胞培养条件和培养环境，并需要付出昂贵的细胞培养成本，不利于工业化生产。
技术实现思路
(一)本专利技术要解决的技术问题是提供一种可用于工业化生产，生产成本低，生产效率高，可用于动物医学基础研究和临床应用的鸡β干扰素的体外制备方法，以弥补目前国内商品化鸡β干扰素的空白。(二)本专利技术的技术方案是1鸡β干扰素成熟蛋白基因的克隆从国内鸡场购买三黄鸡，取鸡肝的全基因组。以GenBank上公布的鸡β干扰素的基因序列为原始模板，利用分子生物学软件I^rimer Primer 5. 0设计一对引物，用于扩增出鸡 β干扰素成熟蛋白基因。2含有鸡β干扰素成熟蛋白基因原核表达载体的构建与鉴定利用PCR的方法扩增的鸡β干扰素成熟蛋白基因的前后两端的酶切位点，把鸡 β干扰素成熟蛋白基因与同样用上述两种限制性内切酶酶切的PET28a表达载体相连， 连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经酶切后电泳，能获得大小为531bp条带的质粒可以鉴定为已连接上鸡β干扰素成熟蛋白基因的重组载体(PET28a-chIFN3 )。4含鸡β干扰素成熟蛋白基因重组载体是否能在大肠杆菌中表达的鉴定把PET28a载体和PET28a-chIFNi3重组载体分别转化BL-21宿主菌，在IPTG加入后进行诱导，并通过SDS-PAGE来鉴定鸡β干扰素成熟蛋白基因是否能在大肠杆菌中进行高效表达。5大肠杆菌表达的鸡β干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺的探索对大肠杆菌表达的鸡β干扰素的包涵体用一些去污剂洗涤处理初步纯化后，再用高浓度变性剂的处理，使其溶解在尿素中，然后利用大肠杆菌表达的鸡β干扰素末端6个组氨酸的标签，通过NI-NTA层析柱进行亲和层析纯化，使其浓度进一步提高，达到作为标准品和商品化生产的要求。在此工程中，确定具体的操作条件和溶液 6大肠杆菌表达的鸡β干扰素生物活性的测定采用国际上通用的微量病变抑制法来测定在大肠杆菌中高效表达后处理之后，是否具有抗病毒的生物学活性。本专利技术中采用的是本实验室从当地三黄鸡中克隆的鸡β干扰素成熟蛋白的基因序列如下tgcaaccatcttcgtcaccaggatgccaacttctcttggaaaagcctccagctccttcagaatacggctccac ctccaccacagccttgcccacaacaagacgtgacttttccatttccagaaacccttctgaagagcaaggacaagaagcaa gcagccatcaccaccctccgcatcctccaacacctcttcaacatgcttagcagcccacacactccaaaacactggattga ccgcacacgccacagcctcctcaaccagatccagcattacatccatcaccttgagcaatgcttcgtaaaccaaggcacgc gctcccagaggcgagggcctcgcaacgctcacctcagcatcaacaaatacttcagatccatccacaacttcctacagcacclclCclclCtacagtgcttgtacctgggaccatgtccgcctccaggctcgtgactgcttccgacacgtggacacactcataca atggatgaaaagtcgagctcctctcacagcctcatccaaacgtctcaacacccagtga 与氨基酸序列如下CysAsn HisleuArgHisGlnAspAla AsnPheSerTrp LysSerLeuGlnLeu LeuGln AsnThr AlaProProProProGlnPro CysProGlnGln AspValThrPhePro PhePro GluThr LeuLeuLysSerLysAspLys LysGlnAlaAla lieThrThrLeuArg lieLeu GlnHis LeuPheAsnMetLeuSerSer ProHisThrPro LysHisTrplieAsp ArgThr ArgHis SerLeuLeuAsnGlnlieGln HisTyrlieHis HisLeuGluGlnCys PheVal AsnGln GlyThrArgSerGlnArgArg GlyProArgAsn AlaHisLeuSerlie AsnLys TyrPhe ArgSerlieHisAsnPheLeu GlnHisAsnAsn TyrSerAlaCysThr TyrAsp HisVal ArgLeuGlnAlaArgAspCys PheArgHisVal AspThrLeulieGln TrpMet LysSer ArgAlaProLeuThr Ala Ser Ser Lys Arg Leu Asn Thr Gln该基因核苷酸序列与GenBank上登陆的鸡β干扰素成熟蛋白基因序列(GenBank:5AY974089. 1)的同源性为99. 8%，氨基酸同源性为100%。该基因与PET28a原核表达载体重组后，在BL-21大肠杆菌中获得了高效表达。且本专利技术中制取的鸡β干扰素具有较高的抗 VSV病毒增殖的生物活性。本专利技术摸索出一套适用于大肠杆菌表达的鸡β干扰素包涵体的变性、纯化、复性的工艺，通过此工艺流程生产出的鸡β干扰素具有抗病毒活性。(三)本专利技术其有益效果是纵观国际鸡β干扰素的的市场，目前国外已有商品化的鸡β干扰素出售，但是国内市场目前还没有利用中国鸡群的基因生产的商品化的鸡β干扰素，这极大限制了相关的基础研究和临床应用步伐。因此总结本专利技术可以带来如下的有益效果1本专利技术可以弥补国内商品化鸡β干扰素的空白一种生物制品走向商品化必须具备两个基本条件，一个是该生物制品确实有使用价值，第二个是相对于使用对象而言，农户使用该生物制品成本要远低于其出售鸡只带来的纯收益。因此对本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种重组鸡β干扰素的生产方法，其特征是由以下步骤构成：　重组载体ＰＥＴ２８ａ－ｃｈＩＦＮβ的构建根据ｇｅｎｂａｎｋ上公布的序列，设计一对引物，通过ＰＣＲ的方法扩增出鸡β干扰素成熟蛋白基因；把鸡β干扰素成熟蛋白基因的ＰＣＲ产物酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的ＰＥＴ２８ａ表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，５３１ｂｐ大小的鸡β干扰素成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组ＰＥＴ２８ａ－ｃｈＩＦＮβ载体已经构建成功，重组载体转化ＢＬ－２１菌后，通过ＩＰＴＧ进行诱导表达；大肠杆菌表达的鸡β干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺将１０００ｍｌ诱导表达菌经８０００ｒｐｍ／ｍｉｎ×１０ｍｉｎ离心后收集的菌体用ｐＨ＝７．２的ＰＢＳ洗涤一次，洗涤后离心的菌体用４０ｍｌ的５０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌＰＨ８．０，　含１ｍＭ的ＥＤＴＡ悬起，－２０℃作用过夜；次日以４５０Ｗ功率的超声波裂解２５ｍｉｎ３Ｓ，３Ｓ后，４℃，２０００ｇ／ｍｉｎ×１０ｍｉｎ离心后取上清，再８０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ后取沉淀，即得重组鸡β干扰素包涵体；包涵体用含１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的５０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌＰＨ８．０，　含１ｍＭ的ＥＤＴＡ溶液洗涤后，再用含２Ｍ尿素的５０ｍＭ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌＰＨ８．０，　含１ｍＭ的ＥＤＴＡ溶液洗涤，洗涤后的沉淀用含１ｍＭ　ＥＤＴＡ和１０ｍＭ的ＤＴＴ的８Ｍ的５０ｍＭ的ＮａＨ２ＰＯ４（ＰＨ８．０），０．３Ｍ的ＮａＣｌ，５０ｍＭ的咪唑溶液４℃搅拌溶解１２ｈ；溶解后的重组鸡β干扰素包涵体变性液上清经０．２２ｕｍ的滤膜处理后，用含ＮＩ－ＮＴＡ层析介质的亲和层析柱对其进行亲和纯化；ＮＩ－ＮＴＡ层析介质装柱后用１０个柱体积的亲和层析的平衡液进行平衡，流速控制在每分钟１ｍｌ；平衡后在层析介质上轻轻铺上经过洗涤纯化的重组鸡β干扰素包涵体变性液，然后加入２０个柱体积的亲和层析漂洗液进行漂洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，最后用５个柱体积的洗脱液进行洗脱；收集洗脱峰放入截留分子量为３ＫＤ的透析带，以含５Ｍ尿素的ＰＢＳ溶液进行透析，每８ｈ换一次透析液，共透析１６ｈ；继而分别以含３Ｍ，１Ｍ尿素的ＰＢＳ溶液进行透析，同样是每８ｈ换一次透析液，不同尿素浓度的透析液各透析１６ｈ，最后以ＰＢＳ溶液透析２４ｈ，每８ｈ换一次透析液；透析复性结束后的鸡β干扰素溶液用０．２２ｕｍ的滤膜后，测定蛋白浓度为０．２６ｍｇ／ｍｌ，－２０℃保存备用，亲和层析的平衡液为含８Ｍ尿素的５０ｍＭ的ＮａＨ２ＰＯ４ＰＨ８．０，０．３Ｍ的ＮａＣｌ，５０ｍＭ的咪唑溶液，漂洗液为含８Ｍ尿素的５０ｍＭ的ＮａＨ２ＰＯ４ＰＨ８．０，０．３Ｍ的ＮａＣｌ，１００ｍＭ的咪唑溶液．洗脱液为含８Ｍ尿素的５０ｍＭ的ＮａＨ２ＰＯ４（ＰＨ８．０），０．３Ｍ的ＮａＣｌ，５００ｍＭ的咪唑溶液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈萍萍，蔡梅红，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84