抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积制造技术

本发明专利技术公开了一种抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积，属于养殖业中对猪胴体品质进行改良的技术。从猪皮下脂肪组织细胞分离纯化分子量为４０．０ｋＤａ特异膜蛋白，以该蛋白为抗原采用杂交瘤细胞技术制备了３株单克隆抗体；抗体为无色透明液体，浓度为１．０ｍｇ／ｍｌ，适用于１５～９０ｋｇ生长肥育猪，于１５ｋｇ仔猪阶段腹腔注射一次，剂量为０．５～１．０ｍｇ／ｋｇ。抗体仅作用于猪皮下脂肪细胞，能显著减少商品猪皮下脂肪沉积，提高胴体品质，对采食量、生长和内脏器官无不良影响，是一种有良好应用前景的减少猪皮下脂肪沉积、提高胴体品质的技术方法。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积，属于养殖业中对猪胴体品质进行改良的技术。
技术介绍
动物脂肪的过度沉积不仅降低畜产品质量，而且威胁人类健康，已成为动物生产领域亟待解决的问题。降低动物体脂肪沉积的一种途径是在饲料中添加化学药物，但化学药物的使用会带来许多问题，如降低肉品的质量、缩短贮藏期、药物残留等；另一种途径是使用激素类物质，如β-肾上腺素能兴奋剂和生长激素等，这类物质虽然能促进动物生长，提高饲料转化效率，减少体脂，增加蛋白质含量，改善胴体品质，但其在畜产品中的残留及安全性已引起公众的担忧，目前已被禁用或限量使用。针对动物体脂肪过度沉积的问题，1986年Flint首先提出了用脂肪细胞膜蛋白制备抗体并将这种抗体注射到动物体内调控脂肪沉积的设想，发表了用大鼠全脂肪细胞膜蛋白制备多克隆抗体的文章，结果发现抗脂肪细胞膜蛋白抗体应用于动物，可显著减少脂肪沉积，这种作用可保持数月不产生任何副作用；这种方法不仅使动物脂肪沉积减少，而且可以使体重增加，饲料转化效率提高。随后Flint在“肥胖能否控制”一文中报道了羊和猪抗脂肪细胞膜蛋白的多克隆抗体，这种抗体在体内可有效地抑制脂肪细胞分化。此后Moloney和Pantonet相继详细报道了抗脂肪细胞膜蛋白多克隆抗体对脂肪细胞作用的效果。由于多克隆抗体特异性较差，可与其它组织细胞膜产生交叉反应，于是1990年Killefer首次报道了抗猪脂肪细胞膜蛋白的单克隆抗体，但没有该单克隆抗体能够抑制脂肪细胞分化的实验数据。同年Wright报道了抗2周龄仔猪脂肪细胞膜蛋白的单克隆抗体，其抗原的相对分子量为77.0kDa和90.0kDa，直接证实了膜表面蛋白是脂肪细胞分化的标志。其后1995年和1997年Wright和Declercq分别制备了抗猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体，Wu于2000年制备了抗鸡脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体。单克隆抗体由于能特异地识别脂肪细胞膜蛋白，与其它组织细胞无交叉反应，因此在减少脂肪沉积的作用效果上比多克隆抗体有更大的优势，同时还可用作探针研究脂肪细胞的分化和代谢以及膜蛋白的组成和结构等，但目前研究制备单克隆抗体所用抗原并非为脂肪细胞特异膜蛋白，因此其特异性有待进一步证实。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种能有效减少猪皮下脂肪沉积、提高胴体品质的技术方法，在不降低生长速度和饲料报酬的前提下明显减少猪皮下脂肪沉积、提高胴体品质，可杜绝在饲料中使用化学合成药物，提高猪肉产品的安全性。上述目的是这样实现的从猪皮下脂肪组织细胞分离纯化分子量为40.0kDa特异膜蛋白，以该蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞技术获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别为2A3、3H7和3A6，采用小鼠体内诱生方法制备了3株单克隆抗体。抗体为无色透明液体，浓度为1.0mg/ml，将抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体作用于15～90Kg生长肥育猪，在15Kg仔猪阶段腹腔注射一次，剂量为0.5～1.0mg/Kg。3株单抗分别属IgA、IgM和IgG1亚类，分子量分别为160kDa、190kDa和150kDa，抗体效价分别为104以上、105以上和106以上，抗体亲和力Ka分别为4.86×108L/mol、1.86×109L/mol和2.46×109L/mol，Wstern-blot检测证明，3株单抗具有很好的抗原结合活性和很强的特异性，仅与皮下脂肪细胞的40.0kDa特异膜蛋白结合，不与其他脂肪及组织细胞膜蛋白结合。以3A6单抗为例Western-blot分析结果见图1、2，2A3和3H7单抗的结果与3A6相同，省略图。获得单克隆抗体之后，以效价和亲和力最高的IgG1亚类单克隆抗体3A6用于动物试验，检测单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积的效果。首先在15Kg仔猪阶段采用腹腔注射一次，剂量为0.1～1.0mg/kg，通过动物饲养试验检测单克隆抗体对猪生长性能的影响，至90Kg试验结束时屠宰，通过屠宰试验测定猪胴体品质；同时取皮下脂肪组织通过冰冻组织切片测定皮下脂肪细胞的大小，并测定皮下脂肪组织的厚度和甘油三酯的含量；然后将单克隆抗体加入体外培养的猪原代前脂肪细胞，观察抗体对体外脂肪细胞分化的抑制作用。抗脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积，将抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体作用于15～90Kg生长肥育猪，在15Kg仔猪阶段腹腔注射一次，剂量为0.5～1.0mg/kg。仅作用于猪皮下脂肪细胞，能显著减少商品猪皮下脂肪沉积，提高胴体品质，对采食量、生长和内脏器官无不良影响，是一种有良好应用前景的减少猪皮下脂肪沉积、提高胴体品质的技术方法。附图说明图1为单克隆抗体识别抗原的Western-blot分析示意图，图中1为40.0kDa纯化抗原，2为脂肪细胞全膜蛋白图2为单克隆抗体组织特异性Western-blot分析示意图，图中1为心、2为肝、3为脾、4为腹部脂肪、5为皮下脂肪、6为肺、7为肾、8为肌肉、9为肠系膜脂肪、10为肾周脂肪，从图中可以看出它仅与猪皮下脂肪和腹部脂肪细胞膜蛋白结合图3为对照组猪皮下脂肪组织冰冻切片放大4为注射0.1mg/kg体重单克隆抗体猪皮下脂肪组织冰冻切片放大5为注射0.5mg/kg体重单克隆抗体猪皮下脂肪组织冰冻切片放大6为注射1.0mg/kg体重单克隆抗体猪皮下脂肪组织冰冻切片放大7为单克隆抗体对猪皮下脂肪厚度的影响示意8为单克隆抗体对猪皮下脂肪甘油三酯含量影响的示意9为单克隆抗体作用于分化的前脂肪细胞，作用第4天，细胞停止分化，崩解后聚积，释放出脂滴的放大10为正常分化的前脂肪细胞，培养第8天的放大11为单克隆抗体作用于分化的脂肪细胞，作用第4天，大部分细胞死亡，脂滴蓄积量显著减少的放大12为正常分化的脂肪细胞，培养第11天的放大13为单克隆抗体作用于成熟的脂肪细胞，作用第6天，大部分细胞崩解或皱缩，脂滴蓄积量显著减少的放大14为正常生长的成熟脂肪细胞，培养第20天，细胞充满脂滴，脂滴圆润，富有光泽的放大15为单克隆抗体作用于成熟的脂肪细胞，作用第6天，细胞崩解，脂滴显著减少，失去光泽的放大16为正常生长的成熟脂肪细胞，培养第20天，脂滴圆润，富有光泽的放大图具体实施方式从猪皮下脂肪组织细胞分离纯化分子量为40.0kDa特异膜蛋白，以该蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交廇细胞技术获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别为2A3、3H7和3A6，采用小鼠体内诱生方法制备了3株单克隆抗体。抗体为无色透明液体，浓度为1.0mg/ml，将抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体作用于15～90Kg生长肥育猪，在15Kg仔猪阶段腹腔注射一次，剂量为0.5～1.0mg/Kg。3株单抗分别属IgA、IgM和IgG1亚类，分子量分别为160kDa、190kDa和150kDa，抗体效价分别为104以上、105以上和106以上，抗体亲和力Ka分别为4.86×108L/mol、1.86×109L/mol和2.46×109L/mol，Wstern-blot检测证明，3株单抗具有很好的抗原结合活性和很强的特异性，仅与皮下脂肪细胞的40.0kDa特异膜蛋白结合，不与其他脂肪及组织细胞膜蛋白结合。以3A6为例，进行了以下试验检测，其它2株单抗的试验检测结果与3A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积，其特征在于：ａ、从猪皮下脂肪组织细胞分离纯化分子量为４０．０ｋＤａ特异膜蛋白，以该蛋白为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤细胞技术获得３株阳性杂交瘤细胞株，分别为２Ａ３、３ Ｈ７和３Ａ６，采用小鼠体内诱生方法制备了３株单克隆抗体；抗体为无色透明液体，浓度为１．０ｍｇ／ｍｌ，３株单抗分别属ＩｇＡ、ＩｇＭ和ＩｇＧ１亚类，分子量分别为１６０ｋＤａ、１９０ｋＤａ和１５０ｋＤａ，抗体效价分别为１０↑［４］以上、１０↑［５］以上和１０↑［６］以上，抗体亲和力Ｋａ分别为４．８６×１０↑［８］Ｌ／ｍｏｌ、１．８６×１０↑［９］Ｌ／ｍｏｌ和２．４６×１０↑［９］Ｌ／ｍｏｌ，ｂ、将抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体作用于１５～９０Ｋｇ生长肥育猪，在１５Ｋｇ仔猪阶 段腹腔注射一次，剂量为０．５～１．０ｍｇ／Ｋｇ。

【技术特征摘要】
1.一种抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体用于减少猪皮下脂肪沉积，其特征在于a、从猪皮下脂肪组织细胞分离纯化分子量为40.0kDa特异膜蛋白，以该蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞技术获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别为2A3、3H7和3A6，采用小鼠体内诱生方法制备了3株单克隆抗体；抗体为无色透明液体，浓度为1.0mg/ml，3株单抗分别属IgA、I...

【专利技术属性】
技术研发人员：高士争，张曦，葛长荣，戴志明，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]