一种克隆鸡细胞视黄醇结合蛋白1基因编码区全序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种克隆鸡细胞视黄醇结合蛋白1基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：A1，对鸡多个组织分别提取mRNA反转录成cDNA，然后把得到的各个组织的cDNA做成cDNA池；A2，以NCBI上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白1基因mRNA序列为模板设计引物，扩增后进行克隆测序；A3，根据mRNA序列来判断尚未包括在扩增片段的序列及相应位置，然后以该基因DNA序列为模板，针对未能扩增到的部分序列设计引物进行扩增，扩增产物送生物工司回收纯化测序；A4，将A2和A3得到的序列进行拼接，就得到目的基因全编码区序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其是。
技术介绍
在功能基因组学研究中要对目的基因的功能进行研究，首先应得到该基因的编码区序列，而目前得到基因编码序列一般进行普通的克隆或做RACE而得到。普通的克隆由于成本低，而成为大多数实验室对目的基因编码区进行克隆的首选方法。但对于目的基因 mRNA参考序列不完整时(无5'和3'调控区，mRNA参考序列即为CDS序列)，普通的克隆不可能恰好能在两端设计引物而把整个CDS区序列包括进去(就算是完整的mRNA序列也不一定能够找到能扩增全编码区序列的引物)，这样的话只能得到不完整的CDS序列。这种情况下，传统方法的是做RACE而得到目的基因的全CDS序列，但其成本较高，而且对提取的 RNA质量较一般克隆要求较高，所以应用相对较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题针对现有技术的不足提供。本专利技术采用以下技术方案，包括以下步骤:A1， 对鸡多个组织分别提取mRNA反转录成cDNA，然后把得到的各个组织的cDNA做成cDNA池； A2，以NCBI上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白1基因mRNA序列为模板设计引物，扩增后进行克隆测序；A3，根据mRNA序列来判断尚未包括在扩增片段的序列及相应位置，然后以该基因 DNA序列为模板，针对未能扩增到的部分序列设计引物进行扩增，扩增产物送生物工司回收纯化测序；A4，将A2和A3得到的序列进行拼接，就得到目的基因全编码区序列。所述的方法，所述鸡多个组织包括心、肝、肾、下丘脑、输卵管、卵巢、垂体。所述的方法，步骤A2中引物为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :3。所述的方法，步骤A3中引物为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5。通过过这两种方法的组合，最终实现对目的基因全编码区序列的克隆。 附图说明图1为本专利技术拼接后得到的序列(阴影部分为CDS序列)；具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。具体实施步骤(1)组织样的采集、mRNA的提取及cDNA片段的制备取12w二郎山山地鸡6只，颈静脉放血后，分别取心、肝、肾、下丘脑、输卵管、卵巢、 垂体七个组织，立即置于液氮中速冻，-70°C保存备用。分别取l-2g组织样添加液氮研磨后，用RNAiso Regent提取鸡心、肝、肾、下丘脑、卵巢、垂体、输卵管七个组织的mRNA，采用分光光度计检测其浓度和纯度合格(0拟60/ 0D280 = 1.8-2.0)后，使用SYBR : PrimeScriptTMRT-PCR Kit按其说明书所述反应条件和反应体系反转录成cDNA，然后将七个组织的cDNA混勻(每个组织一小部分)存放备用。(2)目的片断的扩增①引物设计根据NCBI上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白1基因mRNA(XM_422635. 2) 序列设计引物(见表1)，由引物可知，该对引物扩增片段并未完全包含CDS区域。表1克隆引物序列权利要求1.，其特征在于，包括以下步骤A1，对鸡多个组织分别提取mRNA反转录成cDNA，然后把得到的各个组织的cDNA做成cDNA池；A2，以NCBI上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白1基因mRNA序列为模板设计引物，扩增后进行克隆测序；A3，根据mRNA序列来判断尚未包括在扩增片段的序列及相应位置，然后以该基因DNA序列为模板，针对未能扩增到的部分序列设计引物进行扩增，扩增产物送生物工司回收纯化测序；A4，将A2和A3得到的序列进行拼接，就得到目的基因全编码区序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸡多个组织包括心、肝、肾、下丘脑、 输卵管、卵巢、垂体。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A2中引物为SEQID NO :2和SEQ ID NO3。4.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A3中引物为SEQID NO :4和SEQ ID NO:5。全文摘要本专利技术公开了，包括以下步骤A1，对鸡多个组织分别提取mRNA反转录成cDNA，然后把得到的各个组织的cDNA做成cDNA池；A2，以NCBI上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白1基因mRNA序列为模板设计引物，扩增后进行克隆测序；A3，根据mRNA序列来判断尚未包括在扩增片段的序列及相应位置，然后以该基因DNA序列为模板，针对未能扩增到的部分序列设计引物进行扩增，扩增产物送生物工司回收纯化测序；A4，将A2和A3得到的序列进行拼接，就得到目的基因全编码区序列。文档编号C12N15/10GK102154263SQ20111000873公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日专利技术者刘益平, 朱庆, 肖礼华, 赵小玲 申请人:四川农业大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种克隆鸡细胞视黄醇结合蛋白１基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：Ａ１，对鸡多个组织分别提取ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，然后把得到的各个组织的ｃＤＮＡ做成ｃＤＮＡ池；Ａ２，以ＮＣＢＩ上原鸡的细胞视黄醇结合蛋白１基因ｍＲＮＡ序列为模板设计引物，扩增后进行克隆测序；Ａ３，根据ｍＲＮＡ序列来判断尚未包括在扩增片段的序列及相应位置，然后以该基因ＤＮＡ序列为模板，针对未能扩增到的部分序列设计引物进行扩增，扩增产物送生物工司回收纯化测序；Ａ４，将Ａ２和Ａ３得到的序列进行拼接，就得到目的基因全编码区序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖礼华，朱庆，赵小玲，刘益平，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51