本发明专利技术属于色谱柱填料领域。制备方法步骤：（１）硅胶活化：（２）键合甲基乙烯基；（３）钝化硅胶（４）引发聚合。其应用：乙腈－水作为流动相，梯度条件为０－２０ｍｉｎ，乙腈５％－４０％；２０－２５ｍｉｎ，乙腈４０％－５％，对标准蛋白质或粗蛋白质进行分离，获得三个组分：卵清蛋白、胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白抑制剂色谱图。本发明专利技术柱效高、分离时间短、对蛋白质分离效果好，同时适用ｐＨ范围较宽等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及色谱柱填料的制备，尤其涉及包覆于硅胶基质上的聚合物色谱柱填料的制备。
技术介绍
分离柱是色谱技术的核心，而固定相的研究则是各种高效液相色谱法赖以建立和发展的基础。面对科研和生产中对高纯度物质的需求，开发更有效的制备分离技术、制备色谱的新型填料和蛋白质分离填料是至关重要的。研究开发与生物大分子相适应的分离效率高、选择性好、活性回收和质量回收好、寿命长的固定相是人们始终追求的目标。当前高效液相色谱中使用广泛的固定相主要为硅胶基质键合相和聚合物基质固定相两类。二者各自有其独特的优点和应用范围，硅胶基质键合相机械强度大，但耐pH范围窄2-7.5。而聚合物基质固定相耐pH范围宽0-14，但在有机溶剂中易于溶胀。如果把二者的长处相结合，取长补短，即用硅胶基质作支承体，外面包覆聚合物层，从而得到一种新型填料，更有利于生物大分子的快速分离及活性的回收。该种新型填料较普通硅胶基质填料耐受pH范围加宽，能耐受pH2-10，在溶剂中也不会发生溶胀。另外该种填料的渗透性能好，柱压低，在100％甲醇，流速1ml/min，色谱柱150×4.6mm i.d条件下，柱压仅为5.3MPa，因此能适应高溶剂流速下的快速洗脱分离。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物键合相色谱柱填料及其制备方法。该项目在北京市自然科学基金资助下完成，项目编号2073028. 甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物键合相，其结构式为 n为聚合度，n值的范围是2-7。 制备上述甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物键合相可通过如下方法实现 (1)硅胶活化按盐酸、硅胶体积、质量比2-6ml/g，将体积百分比为20％的盐酸与30nm-300nm孔径的硅胶配制成混合物，加热90-100℃反应回流2-6小时，抽滤、用去离子水洗涤至中性，105℃烘4-8小时，并50℃真空干燥4-6小时，得活化硅胶备用。 (2)键合甲基乙烯基按甲基乙烯基二氯硅烷、硅胶体积、质量比1-3ml/g甲基乙烯基二氯硅烷与上述活化硅胶配制成混合物，再加入5-7倍甲基乙烯基二氯硅烷体积的无水甲苯，在100-120℃、机械搅拌、液面下通N2的反应条件下回流18-24小时，反应完成后先用无水甲苯抽滤、洗涤，再用甲醇抽滤、洗涤，得键合甲基乙烯基硅胶。 反应式 (3)钝化按键合甲基乙烯基硅胶、三甲基氯硅烷质量、体积比1-4g/ml，将上述键合甲基乙烯基硅胶和三甲基氯硅烷配制成混合物，再加入8-10倍三甲基氯硅烷体积的无水甲苯，于100-120℃、机械搅拌、液面下通N2反应条件下回流18-24小时，反应完成后先用无水甲苯抽滤、洗涤，再用甲醇抽滤、洗涤，得钝化硅胶。 反应式 (4)引发聚合称取上述经钝化的键合乙烯基硅胶，50℃真空干燥后，加入钝化的键合乙烯基硅胶质量千分之五-百分之二的引发剂，10-15倍无水甲苯，在100-120℃、机械搅拌、通N2条件下回流3小时后，1ml/min滴加十分之一五分之一上述钝化的键合乙烯基硅胶质量的甲基丙稀酸-2-羟基丙酯、千分之五-百分之二上述钝化的键合乙烯基硅胶质量的交联剂二乙烯基苯、千分之五-百分之二上述钝化的键合乙烯基硅胶质量的引发剂和2-4倍无水甲苯的混合液，待全部加入后，反应18-24小时，反应完成后先用无水甲苯抽滤、洗涤，再用甲醇抽滤、洗涤，得甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶色谱柱填料。 反应式 n为聚合度，n值的范围是2-7。 上述引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈。 应用上述甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物键合相分离蛋白质，以乙腈-水作为流动相，梯度条件为0-20min，乙腈5％-40％；20-25min，乙腈40％-5％，对标准蛋白质或鸡蛋白蛋白粗品进行分离，获得三个组分，分别是卵清蛋白、胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白抑制剂色谱图。液相色谱仪岛津-20A；检测波长280nm和254nm。 本专利技术与现有技术相比，具有柱效高、分离时间短、对蛋白质分离效果好，同时适用pH范围较宽等优点。 附图说明 图1，13，14，15，16依次为5个实施例的四个标准蛋白混合进样的液相色谱图 1-papain(木瓜蛋白酶)；2-insulin(胰岛素)；3-hemoglobin(牛血红蛋白)；4-lysozyme(溶菌酶) 流动相乙腈-水；梯度条件0-20min，5％乙腈-40％乙腈；20-25min，40％乙腈-5％乙腈。 图2为粗蛋白样品液相色谱图 样品鸡蛋白蛋白粗品 流动相乙腈-水；梯度条件0-20min，5％乙腈-40％乙腈；20-25min，40％乙腈-5％乙腈。 图3蛋白质保留与碱流动相洗脱体积关系图 色谱柱150×4.6mm i.d.硅胶聚合物填料，流动相A0.1％TFA水溶液，B0.1％TFA乙腈溶液，20-min从5％B到100％B线性梯度。流速1ml/min，UV-280nm. Peaks1.Yeast ribonuclease(酵母核糖核酸酶)，2.Glucose oxidase(过氧化氢酶)，3.Lysozyme(溶菌酶)，4.Cytochrome C(细胞色素C)，5.Ribonnuclease(核糖核酸酶)，6.Bovineserum albumin(牛血清白蛋白)，7.Chick egg albumin(鸡蛋白蛋白). 图4甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物色谱柱填料红外光谱图 图5硅胶本体红外光谱图 图6硅胶颗粒放大2万倍扫描电镜图 图7硅胶颗粒放大1千倍扫描电镜图 图8甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物色谱柱填料放大2万倍扫描电镜图 图9基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物色谱柱填料放大1千倍扫描电镜图 图10滴水表面张力角测定，水珠滴落前照片 图11滴水表面张力角测定，水珠滴落后照片 图12分子量的对数与相应的保留体积曲线图 使用高效液相色谱仪Waters 600，自制大孔硅质聚合物键合相色谱柱，蒸发光散射检测器，移动相四氢呋喃，流速0.6mL/min。采用已知的不同分子量的标准Ps标样从666到2,000,000g.mol-1，测出各自的保留体积，然后用分子量的对数与相应的保留体积作出曲线图。从曲线图可看出适宜蛋白质分离范围1000-3000000。 wei1硅胶颗粒 wei2键合乙烯基硅胶 wei3甲基丙烯酸-2-羟基丙酯硅胶聚合物填料 具体实施例方式 实施例1(注“键合相”和“色谱柱填料”在本领域是通用，因标题不超过25字写成键合相，但一般都习惯写成色谱柱填料，所以下文中用的为色谱柱填料。) (1)硅胶活化 按盐酸、硅胶体积、质量比为2ml/g，将体积百分比为20％盐酸与30nm孔径硅胶配制成混合物，加热90℃反应回流2小时，抽滤、用去离子水洗涤至中性，105℃烘4小时，并50℃真空干燥4小时，得活化硅胶备用。 (2)键合甲基乙烯基 按甲基乙烯基二氯硅烷、硅胶，体积/质量为1ml/g，将甲基乙烯基二氯硅烷与上述活化硅胶配制成混合物，再加入6倍甲基乙烯基二氯硅烷体积的无水甲苯，在100℃、机械搅拌、液面下通N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲基丙烯酸－２－羟基丙酯硅胶聚合物键合相，其结构式为：＊＊＊ｎ为聚合度，ｎ值的范围是２－７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏芸，王冲，督山伯瑞克，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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