一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法技术

本发明专利技术涉及固定化金属离子亲和色谱材料的制备，具体地说是一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法，以表面带有醛基的有机－无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料；于整体柱材料上连续通过含有胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠ＮａＣＮＢＨ３的磷酸盐缓冲溶液，制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体；将过渡金属离子的水溶液通过材料载体，制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱。利用该固定化金属离子亲和色谱整体柱可以实现混合肽段中磷酸化肽的高选择性富集。本发明专利技术的优点为：对磷酸化肽具有较好的选择性，可反复使用，富集容量较大，回收率较高，且制备方法简便，通透性好、反压小、机械强度好、耐酸碱性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及固定化金属离子亲和色谱材料的制备，具体地说是专利技术了一种基于有 机-无机硅胶杂化基质的磷酸鳌合固定化金属离子亲和色谱柱，应用于磷酸化肽的高选择 性富集。
技术介绍
固定化金属离子亲和色谱是基于固定化的金属离子与磷酸化肽段的磷酸基团之 间的亲和作用，选择性的富集磷酸化肽段的一种技术。相对于其他磷酸化肽富集方法，固 定化金属离子亲和色谱应用最为广泛，对各种磷酸化氨基酸残基都可实现富集。固定化 金属离子亲和色谱技术的发展得到了许多研究人员的广泛关注(Paradela，Α. ；Albar, J. P. J. Proteome Res. 2007,7,1809-1818 & Han，G. H ；Ye, Μ. L. ；Zou, H. F. Analyst 2008， 133，1128-1138)。固定化金属离子亲和色谱的性能与载体和金属鳌合基团的种类密切相关。目前已 有多种载体材料用于酶的固定化，主要有毛细管内壁(Xue, Y. F. ；Wei, J. Y. ；Qian, X. H.； et al.，J. Chromatogr. B. 2009，877，757-764)、颗粒材料(Feng，S. ；Ye，M.L. ；Zou, H. F. ；et al.，Molecular & Cellular Proteomics2007,6,1656-1665)和整体材料(Dong, J. ；Zhou H. J. ；Zou, H. F. ；et al.，J. S印.Sci. 2007，30，2917_四2；3)等。多孔整体材料是近年发展起 来的一种新型的色谱分离介质。通过优化合成条件，可以制备得到同时具有大的通孔和小 的扩散孔的多孔结构整体材料载体，因此具有较好的通透性、较低的反压。对于基于整体材 料的固定化金属离子亲和色谱而言，可固载金属离子的比表面积大，耐酸碱性强，传质速率 得以显著提高。除了载体材料外，金属离子鳌合基团也对固定化酶的性质有较大影响。金 属离子鳌合基团主要有亚氨基二乙酸(IDA) (Aprilita，N. H. ；Huck, C. W. ；Bonn, G. K. ；et al.，J. Proteome Res. 2005，4，2312-2319)、氨基三乙酸(NTA) (Dunn, J. D. ；Igrisan, Ε. A ； Bruening, Μ. L. ；et al.，Anal. Chem. 2008，80，5727-5735)和有机磷酸酸(Feng, S. ；Ye, M.L. ；Zou, H. F. ；et al.，Molecular & Cellular Proteomics 2007，6，1656—1665)。传统 的固定化金属离子亲和色谱材料，每个金属离子仅和一个IDA或NTA配体配位，所以容易在 上样或洗脱过程中损失。而常用的金属离子，如狗3+、(^3+、附2+等也会结合羧基，造成其对 酸性或含组氨酸的肽段的非特异性吸附。所以，我们尝试发展一种基于整体材料的固定化 金属离子亲和色谱柱。该固定化金属离子亲和色谱柱对磷酸化肽具有较好的选择性性，且 富集容量大、回收率高、可重复使用、耐酸碱性强。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法，制备的固定 化金属离子亲和色谱柱应用于磷酸化肽的富集，具有较好的选择性及较高的富集容量。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为以表面带有醛基的多孔有机-无机杂化硅胶整体材料为载体；在杂化硅胶整体材料载体表面，再修饰带有胺基的有机磷酸作为金属离子鳌合基团；最后固定上过渡金属离 子；即制备得到基于有机-无机杂化硅胶整体材料的磷酸鳌合固定化金属离子亲和色谱 柱，可以实现磷酸化肽的高选择性富集。具体为，1)以表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料；2)于整体柱材料上连续泵过含有金属离子鳌合基团的胺甲基磷酸和氰基硼氢化 钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶液，制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体；整体材料载体表面与金属离子螯合的反应基团是磷酸基团；金属离子螯合基团经 过整体材料表面醛基和带有胺基的胺甲基磷酸反应修饰到整体材料基质表面；步骤2、中修饰金属离子鳌合基团的具体过程为将含有l_5mg/mL胺甲基磷酸或 胺乙基磷酸、及2. 5-7. 5mg/mL的氰基-硼氢化钠NaCNBH3的pH = 7. 5-8. 5磷酸盐缓冲溶 液通过整体柱，在室温下反应6-M小时。3)将过渡金属离子的水溶液通过材料载体，制备得到固定化金属离子亲和色谱整 体柱；步骤3)中固定化金属离子的过程为将含有20_100mM Ti (SO4)2或&0C12的水溶 液通过整体柱材料，在室温下反应6- 小时；所制备得到的整体柱用水冲洗0. 5-6小时。4)将制备得到的固定化金属离子亲和色谱柱应用于磷酸化肽的富集，可以高选择 性的结合磷酸化肽；步骤4)中富集磷酸化肽的过程为肽段混合物在酸性条件下上样到整体材料上， 经过乙腈和NaCl溶液的冲洗洗去非特异性吸附的肽段，最后在碱性条件下将亲和富集的 磷酸化肽洗脱下来。本专利技术固定化金属离子亲和色谱整体柱对磷酸化肽有特异性亲和作用，应用于混 合肽段中磷酸化肽的高选择性富集。步骤1)中，金属离子的固定化载体是表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材 料，可以制备在毛细管中，或制备在金属管中，或制备成块状。本专利技术的优点为本专利技术以表面带有醛基的多孔有机-无机杂化硅胶整体材料为 载体，在载体表面修饰磷酸基团鳌合过渡金属离子即可用于磷酸化肽的选择性富集。其制 备方法简便，成本低；制备获得的固定化金属离子亲和色谱柱的对磷酸化肽的选择性好，可 重复使用，且富集容量加大，回收率较高，耐酸碱性强，反压低。附图说明图1有机-无机杂化硅胶整体材料固定化金属离子亲和色谱柱的制备示意图。其 中(a)有机-无机杂化硅胶整体材料载体的制备；(b)载体材料上金属离子的固定化。图2 α -酪蛋白酶解后的产物经固定化金属离子亲和色谱柱富集前(a)和富集后 (b)MALDI-TOF MS分析得到的质谱图；2pmol的α-酪蛋白酶解后的产物经过经固定化金属 离子亲和色谱柱富集，可以明显去除非磷酸化肽的干扰，增加检测到的磷酸化肽的数目。这 说明本专利技术所制备的固定化金属离子亲和色谱柱对磷酸化肽的富集的选择性好性，可以对 有效的富集肽段混合物中的磷酸化肽。图3 α -酪蛋白酶解后的产物经固定化金属离子亲和色谱柱连续富集七次所鉴定到的磷酸化肽数目。同一固定化金属离子亲和色谱柱连续富集七次所鉴定到的磷酸化肽数 目均在11左右，说明本专利技术所制备的固定化金属离子亲和色谱柱可重复使用，重现性好。具体实施例方式本专利技术表面带有醛基的有机_无机杂化硅胶整体材料的制备可参照文献中国专 利，专利申请号200810010347. 9进行。具体操作过程为采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧 基硅烷APTES —起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活性剂为模板分子， 以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶_凝胶法及超分子模板法制备得到了一种有 机_无机杂化硅胶整体材料载体；其中TEOS或TMOS与本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法，其特征在于：１）以表面带有醛基的有机－无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料；２）于整体柱材料上连续通过含有胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠ＮａＣＮＢＨ３的磷酸盐缓冲溶液，制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体；３）将过渡金属离子的水溶液通过材料载体，制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱。

【技术特征摘要】
1.一种固定化金属离子亲和色谱整体柱的制备方法，其特征在于1)以表面带有醛基的有机-无机杂化硅胶整体材料为载体制成整体柱材料；2)于整体柱材料上连续通过含有胺甲基磷酸和氰基硼氢化钠NaCNBH3的磷酸盐缓冲溶 液，制备得到表面带有磷酸螯合基团的整体材料载体；3)将过渡金属离子的水溶液通过材料载体，制备得到固定化金属离子亲和色谱整体柱。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤幻中修饰金属离子鳌合基团的具体过程为将含有l_5mg/mL胺甲基磷酸或胺乙 基磷酸、及2. 5-7. 5mg/mL的氰基-硼氢化钠N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，侯春彦，马俊锋，梁振，张维冰，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]