蛋白酶抑制剂在保护肝细胞功能中的应用制造技术

本发明专利技术涉及Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂（ＫＰＩ／Ａβ　　ＰＰ）、其制备方法和应用，特别是涉及Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本发明专利技术进一步涉及由作为基本活性成分的Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)、其制备方法和应用，特别是涉及KPI/AβPP的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本专利技术进一步涉及由作为基本活性成分的KPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
技术介绍
与牛胰蛋白酶抑制剂相似，来源于人淀粉样β蛋白前体(AβPP)的Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(KPI)是一种能够与丝氨酸蛋白酶结合并抑制丝氨酸蛋白酶活性的肽。作为一种由61个氨基酸组成的多肽，KPI/AβPP分子量相对较小且结构稳定。Kunitz型蛋白酶抑制剂区域(简称KPI或KPI/AβPP)对丝氨酸蛋白酶家族有广泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和凝血因子VIIa IXa Xa XIa XIIa等(例如参见美国专利6,613,890)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，KPI/AβPP的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，缓解与丝氨酸蛋白酶活性升高有关的临床症状，通常可用于预防和治疗心肺转流术(CPB)后的大出血，CPB诱导的炎性反应以及促进伤口愈合等。然而，迄今为止尚未见有关KPI/AβPP对肝细胞的保护功能以及将其用于预防和治疗各种原因导致的病理性急性肝组织损伤和慢性肝纤维化的报道。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供KPI/AβPP在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是以DNA重组技术制备的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的KPI/AβPP是人源的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的病理性肝损伤选自急性或亚急性肝坏死、急性或慢性病毒性肝炎、慢性肝纤维化、中毒性肝炎以及其他原因导致的继发性慢性肝损伤和肝衰竭。本专利技术的另一个目的是提供一种用于肝细胞保护、预防和治疗病理性肝损伤的基础上由KPI/AβPP或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的药物组合物还可含有一种或多种具有协同或辅助作用的天然或合成或重组来源的其他活性成分。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道途径给药的剂型。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的药物组合物被制成适于经胃肠道外途径给药的剂型。 附图说明图1显示重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKPI/AβPP)对体外原代分离的大鼠肝细胞的保护作用。其中图1a显示培养基中加入rhKPI/AβPP实验组肝细胞的生长状态可见肝细胞呈单层生长，细胞轮廓清晰，核大，细胞间连接紧密，仍维持肝细胞的典型形态(100×)。图1b显示培养基中未添加rhKPI/AβPP阴性对照组肝细胞的生长状态细胞数明显减少，仅有大约10％的细胞存活，细胞表面不光滑，结构趋于消失并有融合现象，且有多数细胞死亡(100×)。图2显示rhKPI/AβPP对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠的肝细胞保护作用。其中图2a显示空白对照组的肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核呈圆形，胞质红染，汇管区无炎性细胞浸润(400×)。图2b显示模型对照组的肝细胞肿大，肝小叶中央区呈弥漫性、多发性片状坏死和脂肪变性，炎性细胞浸润明显(200×)。图2c显示大剂量实验组肝小叶周边部分肝细胞轻度水肿及轻微脂肪变性，但未见其他明显的病理改变(200×)。图2d显示甘利欣(江苏正大天晴药业股份有限公司，批号200688)组的肝小叶周边部分肝细胞轻度水肿及少数肝细胞脂肪变性(200×)。图3显示rhKPI/AβPP对CCL4诱导的慢性肝损伤大鼠的肝细胞保护作用。其中图3a显示空白对照组的肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，肝细胞核呈圆形，胞质红染，汇管区无炎性细胞浸润(200×)。图3b显示模型对照组的肝纤维增生明显，将肝小叶分割为大小不等的假小叶，假小叶内中央静脉缺如或偏位，肝细胞脂肪变性，胞浆内可见大小不等的空泡，呈典型肝硬化表现(200×)。图3c显示大剂量实验组的肝细胞轻度脂肪变性，在肝小叶内只见有散在的脂肪变性(200×)。图3d显示促肝细胞生长素组的肝小叶结构模糊，肝小叶周边及汇管区周围肝细胞中度脂肪变性，相互连接成片，小叶中央肝细胞病变较轻(200×)。
技术实现思路
本专利技术涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI/AβPP)、其制备方法和应用，特别是涉及KPI/AβPP的肝细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。本专利技术进一步涉及由作为基本活性成分的KPI/AβPP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。可以利用常规的DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKPI/AβPP)。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的rhKPI/AβPP可以是由原核、真核或酵母表达系统产生的。然而，为了本专利技术目的，优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统。以下简单地描述使用优化的发酵培养条件，在80L发酵罐中工业化大规模生产rhKPI/AβPP的方法。(1)酵母表达载体的构建以人胎盘组织来源的基因组DNA为模板，使用合成的引物15′-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3′和引物25′-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3′，经聚合酶链反应(PCR)扩增得到长度约200bp的产物。酶切后与用同种酶消化的pPICZα载体连接，得到重组质粒pPICZα/prekpi。然后，分别合成一段寡核苷酸单链5′-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3′和5′-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3′(其中包括编码KPI氨基端四个氨基酸和α因子信号肽切割位点Lys-Arg的密码子)。用PstI和XhoI消化重组质粒pPICZα/prekpi并与退火后的寡核苷酸双链连接，得到重组质粒pPICZα/kpi。酶切分析和测序鉴定表明，pPICZα/kpi，重组质粒携带了预期的α因子信号肽和rhKPI/AβPP基因序列。(2)重组质粒的转化、阳性克隆的筛选和表达采用电转化法将pPICZα/kpi转化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin阳性培养基中28℃培养36小时后，挑取单克隆菌落接种于BMGY培养基中，待细菌处于对数生长期(OD600＝2～6)时，重悬于BMMY培养基中继续培养。每隔24小时补加100％甲醇至终浓度为0.5％，以诱导rhKPI/AβPP的表达。诱导后，每隔24小时取上清，用胰蛋白酶和底物盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺进行活性测定，筛选相对高表达量的菌株。(3)大规模发酵工艺将高密度的(OD600＝10)酵母工程菌接种于含甘油(5％，V/V)加痕量盐(4.34ml PTM1/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培养基中，在温度28℃、pH 3.3、溶解氧浓度20％、搅拌速度600转/分钟，罐内压力12psi条件下，在发酵罐罐内发酵培养30小时。当湿细胞重量本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.Kunitz型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗病理性肝损伤相关疾病的药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是以DNA重组技术制备的。3.根据权利要求1的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是人源的。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜炜群，贺巾超，
申请(专利权)人：吉林圣元科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]