用于样品中核酸的同时、定量测量的系统和方法。通过与寡探针杂交将靶核酸的荧光标记的扩增子固定在基底表面，该寡探针已经以预定的二维模式排列并且系于基底表面。然后使用合适波长的渐消波光通过激发其荧光标记，检测杂交的扩增子。由于渐消波的有限穿透（约１００～３００ｎｍ），反应室剩余部分中的荧光标记的核苷酸不发荧光。通过测量基底表面各个位置的荧光，可测定每一靶核酸的杂交的扩增子的当前丰度。然后可以使用实时ＰＣＲ的分析技术获得样品中每一核酸的准确、定量测量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
为了改进原始的PCR方法，20世纪90年代中期，开发4了实时聚合酶链反应(实时PCR)，其在某种程度上避免这些困难 并且提供样品中任何靶DNA拷贝数的可靠的、准确的定量测量。在 实时PCR中，将仅当与靶DNA结合时才有活性的荧光探针添加入 PCR緩冲液中。这些荧光探针是单链DNA，链中部有与靶DNA互 补的核苷酸序列。该中部的每一侧，是彼此互补的延伸核苷酸序列， 以便未附着的探针可以以发夹构型自身折叠。荧光探针一端有荧光分 子，另一端有荧光猝灭分子。所以未附着的、折叠的探针有彼此相邻 的发荧光和猝灭分子，并且因此当照射未附着的探针时没有荧光被发 射。然而，当荧光探针附着于其靶DNA时，探针是非折叠的，这样 发荧光和猝灭分子彼此分离。当用合适波长的光照射附着的探针时， 荧光分子因此发射荧光。图3是在PCR方法的变性阶段微阵列PCR反应中能进行 渐消波检测荧光标记的扩增子的示例性筒的横截面视图。)对 所述靶DNA循环阈值(CT)的示例性图。详述本专利技术提供能实时、同时、定量测量样品中多个核酸的系 统和方法。0025]在示例性实施方案中，用聚合酶链反应(PCR)扩增样品 中的核酸。PCR是众所周知的扩增一个或多个脱氧核糖核酸(DNA) 链的方法，其开始于将靶DNA置于含有引物DNA，核苷酸腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟噪呤(G)(共同称为dNTP)， DNA聚合酶和引物的緩冲液中。引物是短链DNA，其具有与要扩增 的核酸一端互补的序列。引物启动耙DNA的复制。0026PCR方法有三个主要的步骤变性、退火和延伸。在变性 步骤中，将混合物加热至约94"C,在此温度下所有的DNA分离成单 链。然后将混合物快速冷却。当温度降至约60匸时，退火步骤发生， 在此步骤中引物与靶DNA上其互补序列杂交或结合.然后为进行延 伸步骤将温度升至最佳72~78"的范围之内。在此步骤中，DNA聚 合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火后的引物，并且形成称为扩增子 的DNA新链。扩增子是原始乾DNA链的互补拷贝，并且最初以双 螺旋构型与其结合。然后将混合物短暂地重新加热回约94C以使 新形成的双螺旋链分离成单链核酸，且这样开始了 PCR方法的另一 个循环。对于每个PCR方法的循环，原始靶DNA的拷贝数大概翻倍。在PCR方法的退火和延伸阶段期间，荧光标记的靶扩增子 与其相应的寡探针杂交。然后用合适波长的光的渐消波照射杂交的、 荧光标记的靶扩增子，以激活标记的dNTPs的荧光染料分子。这种 渐消波通过寡探针系于其上的基底表面进入反应室后以指数幂衰 减，其有效穿透范围大约为300nm。这就意味着渐消波穿透反应室的 深度足以激活与那些寡探针杂交的荧光标记的扩增子，但是不能激活7在反应室主体的溶液中的荧光标记的dNTPS。通过监控基底表面各 个位置的荧光强度，可以测定相应靶DNA的扩增子的当前丰度。这 可以在PCR反应进行时实时完成，并且结果用于获得原始样品中特 定靶丰度的定量测量，在某种意义上类似于实时PCR计算。荧光标记的dNTPs 24是用荧光染料标记的核苷酸，例 如，但不限于，荧光素或罗丹明绿色染料，或有类似发荧光特性的类 似的、相关化合物，如官能化或嵌入染料和发光的、官能化的纳米颗 粒(nanoparticle)("量子点")。dNTPs 24可以具有荧光标记的四 个碱基核苷酸dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP中的一个、两个、三 个或四个。在优选的实施方案中，仅将核苷酸之一标记，例如，仅仅 dCTP。虽然上述讨论已经用PCR作为示例性的反应，但是对本的方法，例如，-但不限于，逆转录pcr、随机引物扩;:滚环扩增或线性扩增"T7"。0050虽然上述讨论已经将焚光标记的dNTP用于标记耙 DNA,但是对本领域的技术人员显而易见的是将相关结构，例如，但ii不限于，荧光标记的引物、官能化的纳米颗粒、或嵌入染料用于标记把DNA。[0051虽然为了筒单起见，已经按照两个靶核酸讨论了上述讨 论，但是对本领域的技术人员显而易见的是将本方法和装置用于一个 耙核酸或多个靶核酸的定量评估。0052虽然已经用对结构特征和/或方法行为特定的语言进行了 描述，但是应该理解在附加权利要求中定义的本专利技术不需要限于所描 述的特定特性或行为。而是，以实现请求保护的专利技术的示例性形式， 公开特定的特性和行为。权利要求1. 定量分析靶核酸的方法，其包括步骤提供所述靶核酸的荧光标记的扩增子；提供有上表面的基底；提供与所述基底上表面紧密靠近的寡探针；将所述荧光标记的扩增子与所述寡探针退火；使用预定波长的渐消波，由与所述寡探针杂交的所述荧光标记的扩增子激活荧光；检测所述荧光以用于定量分析所述靶核酸。2. 权利要求1的方法，其中提供荧光标记的扩增子包括步骤提供荧光标记的核苷酸，并且执行包括变性、退火和延伸步骤的扩增反应循环。3. 权利要求2的方法，其中将所述荧光标记的扩增子与所述寡探针退火发生在所述聚合酶链反应的所述退火步骤期间。4. 权利要求2的方法，其中检测所述荧光的所述步骤发生在所述扩增反应的所述退火或延伸步骤期间。5. 权利要求1的方法，其中提供与所述基底紧密靠近的寡探针的所述步骤进一步包括用微阵列印刷机将所述寡探针印刷于所述基底上和将所述寡探针固定于所述基底上的步骤。6. 在权利要求5中所述的方法，其中固定所述寡探针的所述步骤进一步包括使所述基底带正电荷。7. 在权利要求6中所述的方法，其中带正电荷的所述步骤进一步包括用选自硅烷、抗生物素蛋白、或聚-L-赖氨酸、或其组合的试剂涂覆所述基底。8. 权利要求l的方法，其中所述扩增反应是实时聚合酶链反应。9. 用于定量分析靶核酸的装置，其包括有上表面和下表面并且折射率大于水的折射率的基底;充分与所述基底的所述上表面接触的緩冲液，所述緩冲液能支持扩增反应并且含有荧光标记的核苷酸和所述靶核酸；与所述基底的所述上表面紧密靠近并且在所述緩冲液中的寡探针，所述寡探针具有与所迷靶核酸的核苷酸序列相应或互补的核苷酸序列； 一束光，其具有选择用于激活所述荧光标记的波长，在所述基底和所述緩冲液之间的界面上以一定角入射，选择所述角从而使渐消波传播入所述援冲液；能检测所述荧光标记发射的荧光的检测器。10. 权利要求9的装置，进一步包括能循环所述緩沖液温度的加热元件，因此使得能够发生所述扩增反应。11.权利要求9的装置，其中所述扩增反应是实时聚合酶链反应。全文摘要用于样品中核酸的同时、定量测量的系统和方法。通过与寡探针杂交将靶核酸的荧光标记的扩增子固定在基底表面，该寡探针已经以预定的二维模式排列并且系于基底表面。然后使用合适波长的渐消波光通过激发其荧光标记，检测杂交的扩增子。由于渐消波的有限穿透(约100～300nm)，反应室剩余部分中的荧光标记的核苷酸不发荧光。通过测量基底表面各个位置的荧光，可测定每一靶核酸的杂交的扩增子的当前丰度。然后可以使用实时PCR的分析技术获得样品中每一核酸的准确、定量测量。文档编号C12Q1/68GK101501212SQ200580044154 公开日2009年8月5日 申请日期2005年10月21日 优先权日2004年10月22日专利技术者L·徐 申请人:霍尼韦尔国际公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
定量分析靶核酸的方法，其包括步骤：提供所述靶核酸的荧光标记的扩增子；提供有上表面的基底；提供与所述基底上表面紧密靠近的寡探针；将所述荧光标记的扩增子与所述寡探针退火；使用预定波长的渐消波，由与所述寡探针杂交的所述荧光标记的扩增子激活荧光；检测所述荧光以用于定量分析所述靶核酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：L徐，
申请(专利权)人：霍尼韦尔国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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