一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法技术

本发明专利技术公开了一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，由真菌菌种准备、接种物准备、动物准备、动物接种和接种后处理步骤组成。本发明专利技术具有以下优点：模型制作成功率高，一般远交系动物成功率达８５％以上，近交系动物成功率可达９０％以上；不依赖免疫抑制剂，接种后第２－１３天角膜病理切片中均可观察到真菌菌丝；操作方法经济简单易行，材料容易得到；接种方法容易掌握，对研究者无特殊技术要求，并符合真菌性角膜炎临床自然感染过程，适用于感染的发生、发展及其机制的研究。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学模型，尤其涉及一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制 作方法。
技术介绍
真菌性角膜炎是一种致盲率很高的感染性角膜溃疡，随着抗生素和糖皮质 激素的广泛应用以及对本病的认识和诊断水平的提高，其发病率不断增高。常 见致病真菌有镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属、念珠菌属，在我国农民患者居 多，常发生于植物性角膜外伤后。目前对角膜真菌感染基础研究极少，其发病 机制不清，缺乏模拟人角膜真菌感染的动物模型严重阻碍了真菌性角膜炎的基 础研究。目前公开的有以下几种真菌性角膜炎动物模型制作方法1. 角膜基质注射法将标准菌株接种于沙堡氏培养基或马铃薯葡萄糖培养 基培养72小时，实验时配制成新鲜的真菌混悬液，将混悬液作角膜板层间注射， 为了提高真菌的感染率和维持角膜的持续感染，部分研究在接种真菌的前一天， 将实验动物球结膜下注射一定量的类固醇激素，但获得的是深层角膜炎模型， 多用于抗真菌药的研究。动物模型已严重破坏了角膜的板层结构，表现为从基 质开始溃烂，不符合真菌性角膜炎的自然发病过程，不具备早或中期真菌性角 膜炎的病理特点。2. 角膜划痕法2003年Wu等应用NIH Swiss小鼠和BALB/C小鼠，分别 在接种前5天、l天肌肉注射甲基强的松龙100mg/kg，或在接种前5天、3天、 1天注射环磷酰胺180mg/kg，然后用皮下针头在角膜表面格子样划痕，表面涂 0.005ml白色念珠菌混悬液，闭合眼睑数秒使真菌均匀分布。实验中没有应用免 疫抑制剂的小鼠接种后角膜内真菌量迅速下降。2004年他们又用相同方法接种 腐皮镰刀菌，发现病理切片中，没有应用免疫抑制剂的BALB/C小鼠接种后第 四天角膜基质中即不能检査到或偶尔有很少量真菌菌丝，所以这种方法是以预 先使动物处于免疫低下状态为基础的，而临床上大部分真菌性角膜炎患者发病 时并非处于免疫抑制状态，不符合临床自然发病过程，而且划痕深浅不易掌握， 易致角膜穿孔，不适用于感染的发生、发展及其机制的研究。3. 角膜接触镜法1999年O，Day等提出新方法，将实验兔分为四组，三 组分别在接种真菌前一天结膜下注射曲安奈德，分别给予lmg、 3mg、 12mg的 剂量，另外一组不注射，完整刮除兔角膜中央直径7mm范围的上皮，然后覆盖上软性角膜接触镜，在接触镜与角膜层间注入0.1ml菌液浓度为1010CFU/ml的 白色念珠菌，再行暂时性睑裂缝合术，24小时后打开睑裂并去除角膜接触镜， 发现没有应用曲安奈德的动物菌丝侵入限制在基质前部，且很稀少。应用曲安 奈德的感染真菌量大，菌丝密度高，且随着皮质类固醇量的增加而感染加重。 此方法感染成功率较高，可不依赖皮质类固醇激素，但制作过程较复杂，而且 与人感染真菌性角膜炎过程不同，所需角膜接触镜造价高，不适合广泛推广应 用。4.角膜表面镜片术法有实验室应用角膜镜片术建立浅层真菌性角膜炎模 型制备带有2mm巩膜环的兔角膜植片，麻醉兔后切除角膜上皮，将角膜植片 放射状缝合于受体角膜的周边部。将lml念珠菌液注入植片与植床角膜层间中 央。也有报道用标准菌株感染离体角膜，然后将感染的角膜植片缝合于刮除上 皮的兔角膜表面，暂时缝合眼睑，2448小时后拆除感染角膜。这两种方法感 染成功率高，都避免了激素对实验结果的影响，但不符合临床自然感染病程， 方法操作过程相对复杂，对实验者的手术技术水平有一定的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单易行，材料容易得到，对研究者无特殊 技术要求、模型制作成功率高的模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案 一种模拟人角膜真菌感染的 动物模型的制作方法，由真菌菌种准备、接种物准备、动物准备、动物接种和 接种后处理步骤组成，在接种物准备步骤中，选用真菌容易附生的植物性接种 载体，修剪成合适尺寸，经高压消毒灭菌后放入真菌培养管中，使真菌在其表 面生长，15 —35匸下培养3—6天；在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的鼠科动物，接种前三天用抗菌药滴眼；在动物接种步骤中，将动物麻醉后，严格无菌条件下用带有所需真菌的接 种物在动物角膜表面划痕，深度达浅基质层，划痕后行睑裂缝合术；在接种后处理步骤中，接种24小时后打开眼睑，每天使用抗菌药滴眼。 在接种后处理步骤中，加用免疫抑制剂滴眼，每天2 — 5次。 所述的免疫抑制剂为肾上腺皮质激素或环孢素。 所述的肾上腺皮质激素为泼尼松龙、泼尼松或地塞米松。 所述的鼠科动物为远交系或近交系小鼠或大鼠。 所述的植物性支撑物为农作物或木本植物的根、茎、叶或果实外壳。 所述的农作物为玉米、高粱、棉花、绿豆、黄豆、小麦或稻。所述的木本植物为杨树、梧桐、榆树、槐树等。在真菌菌种准备步骤中，选用所需真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖培养基或沙堡氏培养基，15—35。C培养3 — 5天。所述的真菌为镰刀菌属、曲霉菌属、弯孢菌属或青霉菌属。本专利技术具有以下优点模型制作成功率高， 一般远交系动物成功率达85% 以上，近交系动物成功率可达90%以上；不依赖免疫抑制剂，接种后第2—13 天角膜病理切片中均可观察到真菌菌丝；操作方法经济简单易行，材料容易得 到；接种方法容易掌握，对研究者无特殊技术要求，并符合真菌性角膜炎临床 自然感染过程，适用于感染的发生、发展及其机制的研究。具体实施例方式实施例1:真菌菌种准备选用所需真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖培养基或沙堡氏培养基，15-35C培养3 —5天。所述的真菌为镰刀菌属、曲霉菌属、弯孢菌属、青霉菌属等所有丝状菌属。接种物准备因真菌性角膜炎多由植物性外伤引起，真菌性角膜炎常见致 病菌又多系植物性附生菌，所以选用真菌容易附生的各种植物性支撑物，如玉米，高粱，棉花，豆科，小麦，稻等农作物及木本植物如杨树、梧桐、榆树、 槐树等的根、茎、叶或者果实外壳等修剪成合适尺寸，经高压消毒灭菌后放入真菌培养管中，使真菌在其表面生长，15—35。C下培养3 — 6天，使其表面的二分之一以上长满真菌。动物准备选用无眼部疾患的鼠科动物，如各种远交系或近交系小鼠、大鼠，每种菌种选用60只动物，接种前三天用抗菌药滴眼，每天三次，预防细菌感染。动物接种动物麻醉后，严格无菌条件下用带有所需真菌的接种物在动物角膜表面划痕，深度达浅基质层，划痕后行睑裂缝合术。接种后处理及观察24小时后打开眼睑，每天使用抗菌药滴眼，预防细菌感染。每天裂隙灯显微镜下观察病情变化，分别于接种后第2， 4， 6， 8， 13天 的相同时段取10只小鼠，处死后摘除左右眼球，IO只眼球于无菌生理盐水中充 分漂洗5分钟，研碎后接种于该属菌最适合生长的培养基，另10只眼球固定48 小时后行组织病理学检査。经观察分析，本方法具有以下优点1.模型制作成功率高， 一般远交系动物成功率达85%以上，近交系动物由 于基因位点纯合，可遗传体征一致，个体差异小，成功率可达90%,接种后第 三天即可观察到典型的真菌性角膜炎病变，第4一7天为感染高峰期。将角膜取 下剪碎，培养于沙堡氏培养基，2周内可见所接种真菌生长。2. 不依赖免疫抑制剂，接种后第2—13天角膜病理切片中均可观察到真菌 菌丝。国际上不依赖免疫抑制剂应用皮下针划痕法接种，在接种第四天以后角 膜组织病理切片中即不能观察到真菌菌丝或偶尔可见极少量菌丝。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，由真菌菌种准备、接种物准备、动物准备、动物接种和接种后处理步骤组成，其特征在于：　　　　在接种物准备步骤中，选用真菌容易附生的植物性接种载体，修剪成合适尺寸，经高压消毒灭菌后放入真菌培养管中，使真菌在其表面生长，１５－３５℃下培养３－６天；　　　　在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的鼠科动物，接种前三天用抗菌药滴眼；　　　　在动物接种步骤中，将动物麻醉后，严格无菌条件下用带有所需真菌的接种物在动物角膜表面划痕，深度达浅基质层，划痕后行睑裂缝合术；　　　　在接种后处理步骤中，接种２４小时后打开眼睑，每天使用抗菌药滴眼。

【技术特征摘要】
1、一种模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，由真菌菌种准备、接种物准备、动物准备、动物接种和接种后处理步骤组成，其特征在于在接种物准备步骤中，选用真菌容易附生的植物性接种载体，修剪成合适尺寸，经高压消毒灭菌后放入真菌培养管中，使真菌在其表面生长，15-35℃下培养3-6天；在动物准备步骤中，选用无眼部疾患的鼠科动物，接种前三天用抗菌药滴眼；在动物接种步骤中，将动物麻醉后，严格无菌条件下用带有所需真菌的接种物在动物角膜表面划痕，深度达浅基质层，划痕后行睑裂缝合术；在接种后处理步骤中，接种24小时后打开眼睑，每天使用抗菌药滴眼。2、 如权利要求1所述的模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，其特 征在于在接种后处理步骤中，加用免疫抑制剂滴眼，每天2 — 5次。3、 如权利要求2所述的模拟人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，其特 征在于所述的免疫抑制剂为肾上腺皮质激素或环孢素。4、 如权利要求3所述的模型人角膜真菌感染的动物模型的制作方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽娅，王璐璐，吴细丕，孙声桃，张俊杰，魏秋彩，
申请(专利权)人：王丽娅，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]